禽致病性大肠杆菌OmpT质粒编码外膜蛋白的表达、纯化与结构的初步研究

发布时间：2020-04-05 04:24

【摘要】：禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是引起禽大肠杆菌病的主要病原,该病临床主要表现为大肠杆菌性败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎等,给世界养禽业带来了巨大的经济损失。APEC的毒力因子众多,其中,外膜蛋白是在宿主-病原体界面发挥核心作用的关键毒力因子。外膜蛋白T(Outermembraneprotein T,OmpT)是存在于大肠杆菌外膜的一种蛋白水解酶,属于Omptin外膜蛋白酶家族,可能在细菌感染宿主的粘附过程中发挥作用。大肠杆菌K12菌株染色体编码的OmpT是Omptin家族中第一个被解析结构的蛋白,该OmpT由10条反向平行的β折叠构成中空的桶状结构,从细菌外膜的脂质双分子层伸向细胞外。本实验室在研究中发现,APEC E058株(02血清型)既有染色体基因(compT)编码的 OmpT(cOmpT),也有 ColV 质粒基因(pompT)编码的 OmpT(pOmpT),cOmpT与pOmpT的氨基酸同源性高达73.6%。目前关于染色体编码的cOmpT研究相对充分,但质粒编码的pOmpT研究很少。本实验室的前期研究结果表明,cOmpT能够水解鱼精蛋白;pOmpT在APEC的致病中具有重要作用,却不具有cOmpT水解鱼精蛋白的能力。因此,我们有必要对pOmpT进行晶体学研究,以期从结构角度解析pOmpT和cOmpT功能差异的原因。在本研究中,我们构建了不含信号肽的pOmpT重组蛋白表达菌株BL21(DE3)pET30a-pompT并对该菌株进行诱导表达,获得了包涵体形式的pOmpT蛋白,体外变性和复性结果表明,获得的pOmpT目的蛋白在凝胶过滤层析后出现自水解,不利于后续结晶试验。根据相关文献报道,cOmpT蛋白进行K217G点突变后可以避免自水解,在此基础上,我们构建了 BL21(DE3)pET30a-popmT(K217G)和 BL21(DE3)pET30a-pompT(K217G)-His表达菌株,诱导表达获得了 pOmpT(K217G)和pOmpT(K217G)-His蛋白,发现二者同样可以有效避免自水解。带有His标签的蛋白可以在镍柱纯化的同时进行结晶去污剂交换,配合后续的凝胶过滤层析进一步纯化,为结晶实验作准备。我们对获得的高纯度蛋白进行了结晶条件初筛。对pOmpT(K217G)蛋白所生长的晶体进行衍射,均为假阳性盐晶,而pOmpT(K217G)-His基本均为蛋白晶体,故后续试验均以pOmpT(K217G)-His进行优化筛选。在对结晶条件MemMeso-17进行优化后,获得了衍射度约为7A的晶体,且该条件下的晶体生长稳定。我们对pOmpT蛋白稳定结晶条件的大量摸索,为最终获得pOmpT晶体结构并阐明pOmpT的生物学功能积累了宝贵数据。另外,我们还构建了含有cOmpT信号肽的BL21(DE3)pET30a-compT-His、BL21(DE3)pET30a-compT(K237G)-His 表达菌和含有 pOmpT 信号肽的 BL21(DE3)pET30a-pompT-His、BL21(DE3)pET30a-popT(K237G)-His 表达菌株,以野生株 E058 和空载体菌 BL21(DE3)pET30a为对照,测定了六个菌株对鱼精蛋白的水解能力。结果发现,未经突变的cOmpT能水解鱼精蛋白,而经K237G点突变(即不含有信号肽的K217G位点突变)的cOmpT不能水解鱼精蛋白,pOmpT无论是否突变,都不能水解鱼精蛋白。结果表明,K237氨基酸位点不仅在cOmpT和pOmpT蛋白稳定中发挥关键作用,且在cOmpT水解鱼精蛋白的酶活性中同样十分重要。
【图文】：

在接近ＯｍｐＴ的顶部，ｐ折叠形成了一个直径约为３２邋Ａ的圆。而在中间部分，横截面逡逑呈约１３Ａｘ邋２６邋Ａ的椭圆，以上数据皆是根据ａ位Ｃ原子的位置进行判定的在膜区域内，，逡逑桶是高度规则的、中空的、其内带正电荷（见图１－３Ａ）邋［３１］。膜上方的桶状结构收缩扭曲，逡逑７邋个侧链（Ｓｅｒ２２，Ｔｈｒ７３，Ａｒｇ７７，邋Ｇｌｎ２２８，Ａｓｎ２５８，邋Ｌｙｓ２５９邋和邋Ｌｙｓ２６０），从氢键到ｐ折叠逡逑中的主链原子，这个收缩区域呈多层，主要由保守的芳香族残基组成，形成了一个大的、逡逑带负电荷的沟底，其中包含蛋白水解活性位点，与ＯｍｐＴ能够识别两个连续的碱性氨基酸逡逑这一特性一致（见图３Ａ）邋［３２】。这个沟部含有共１８个氨基酸残基，全部是0ｍｐｔｉｎ外膜蛋逡逑白酶家族的保守序列［３１】。ＬＰＳ对ＯｍｐＴ蛋白酶功能的激活具有重要作用【３ｉ，３３］。0ｍｐＴ膜外逡逑部分最外层的环，位于ＬＰＳ结合位点核心区域边缘的正上方，将0ｍｐＴ分子沿着筒轴旋转逡逑９０°

逦Ｔ３逦１７逡逑图１－２．邋ＯｍｐＴ捅状结构拓扑模型Ｐｉ】逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２．邋ＯｍｐＴ邋ｂａｒｒｅｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｔｏｐｏｌｏｇｙ邋ｍｏｄｅｌｆ３１Ｊ逡逑注：氨基酸残基以单字母形式给出。正方形表示ｐ－链中的氨基酸残基。侧链指向ｐ桶外侧的氨基酸标记逡逑为灰色。位于细胞外的环标记为Ｌ１－Ｌ５，周质转角标记为Ｔ１－Ｔ４。每２５个残基编号一次。灰色区域表逡逑示外膜的大概位置。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｇｉｖｅｎ邋ｉｎ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｌｅｔｔｅｒｓ．邋Ｓｑｕａｒｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐ－ｓｔｒａｎｄ．逡逑Ｔｈｅ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｓｉｄｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｐｏｉｎｔｉｎｇ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｏｕｔｓｉｄｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｅｔａ邋ｂａｒｒｅｌ邋ｉｓ邋ｇｒａｙｅｄ邋ｏｕｔ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ逡逑ｒｉｎｇ邋ｉｓ邋ｌａｂｅｌｅｄ邋ＬＩ－Ｌ５邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ邋ｃｏｒｎｅｒ邋ｉｓ邋ｌａｂｅｌｅｄ邋Ｔ１－Ｔ４．邋Ｎｕｍｂｅｒｅｄ邋ｅｖｅｒｙ邋２５邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｇｒａｙ邋ａｒｅａ逡逑ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈｅ邋ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｏｕｔｅｒ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ．逡逑在接近ＯｍｐＴ的顶部，ｐ折叠形成了一个直径约为３２邋Ａ的圆。而在中间部分，横截面逡逑呈约１３Ａｘ邋２６邋Ａ的椭圆，以上数据皆是根据ａ位Ｃ原子的位置进行判定的在膜区域内，逡逑桶是高度规则的、中空的、其内带正电荷（见图１－３Ａ）邋［３１］。膜上方的桶状结构收缩扭曲
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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本文编号：2614535