FLCN调控奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成的研究

发布时间：2020-04-05 05:56

【摘要】：奶牛乳腺发育和泌乳受到多种信号通路的严格调控,揭示和阐明泌乳相关的信号通路以及乳腺代谢调控网络是泌乳生物学领域的重要研究内容,为提高奶品质和奶产量提供理论基础。Folliculin(FLCN)基因作为抑癌基因,广泛参与多种代谢途径和细胞过程,在细胞粘附、细胞凋亡、信号转导、蛋白质合成和线粒体生物合成等方面发挥重要作用,但在奶牛乳腺中FLCN的表达及其功能未见报道。本研究针对FLCN在细胞代谢、增殖、凋亡和信号转导方面的功能以及相互作用蛋白进行分析,旨在揭示FLCN调控奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成的分子机理。实验首先采用激光共聚焦检测FLCN在青春期、泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达,以鉴定FLCN在奶牛乳腺发育各时期的表达定位及表达差异。为确定FLCN对奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳的作用,本实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,对FLCN进行基因干扰和过表达调控,并采用 qRT-PCR 和 Western blot 检测 AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、Caspase3和β-酪蛋白的表达,同时利用流式细胞仪检测细胞增殖。实验通过Co-IP和质谱鉴定技术研究FLCN与腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)的相互作用关系。为进一步确定FLCN对AMPK信号通路的调控作用,本研究对奶牛乳腺上皮细胞中FLCN基因进行过表达和干扰,并在培养基中分别添加AMPK激活剂和抑制剂,Western blot 检测 FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1 和 β-酪蛋白的表达。实验通过无糖培养基处理奶牛乳腺上皮细胞,并利用qRT-PCR和Western blot检测无糖培养条件下 FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、ACC 和 β-酪蛋白表达变化,研究FLCN对奶牛乳腺上皮细胞能量代谢的调节作用。激光共聚焦检测结果显示FLCN主要定位于奶牛乳腺上皮细胞,并且在青春期和泌乳期乳腺组织中高表达,干奶期乳腺组织表达较低,说明FLCN可能参与奶牛乳腺发育和泌乳的调节。本实验进一步检测了 FLCN过表达和抑制对乳蛋白合成、细胞增殖和凋亡的影响。结果显示,FLCN过表达可以上调mTOR和β-酪蛋白的蛋白质表达水平,并促进mTOR发生磷酸化,而抑制实验结果与过表达相反。细胞活力检测结果显示,过表达FLCN使细胞数明显增加,且细胞活力显著增强。此外,过表达FLCN的乳腺上皮细胞增殖率显著高于空白对照组和转染空载体组,且处于S期和G2-M期的细胞百分比均明显升高,而G1期细胞百分比明显下降。抑制实验结果与过表达相反。过表达和抑制FLCN实验还显示FLCN正调节细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,结合流式细胞仪的检测结果说明FLCN促进细胞增殖。另外,结果显示FLCN负调节凋亡蛋白Caspase3的表达,同时发现FLCN负向调控AMPK表达水平,并且抑制其磷酸化。以上实验结果表明,FLCN正向调节mTOR的磷酸化水平从而促进乳蛋白合成和细胞增殖,抑制细胞凋亡,并且负调控AMPK。本实验通过Co-IP和质谱鉴定技术研究FLCN与AMPK的相互作用关系。结果显示,当采用AMPK抗体进行Co-IP时,在IP产物中检测到FLCN及其结合蛋白FINP1;采用FINP1抗体进行Co-IP时,在IP产物中检测到AMPK和FLCN蛋白。结果表明FLCN及其结合蛋白FINP1与AMPK存在相互作用关系,提示FLCN参与AMPK信号通路的调节。本研究对奶牛乳腺上皮细胞中FLCN基因进行过表达和干扰,并在培养基中分别添加AMPK激活剂和抑制剂,进一步确定FLCN对AMPK信号通路的调控作用。结果显示,当AMPK激活时,FLCN蛋白表达升高,mTOR表达及磷酸化降低,Cyclin D1和β-酪蛋白的表达降低。AMPK活性抑制时结果相反。研究结果表明AMPK正调控FLCN的表达,负调控mTOR表达及活性,抑制乳蛋白合成和细胞增殖。结合之前的研究结果FLCN过表达抑制AMPK的表达及磷酸化,AMPK激活反而促进FLCN的表达,这样AMPK与FLCN形成负反馈作用。本实验又研究了 FLCN对奶牛乳腺上皮细胞乳腺能量代谢的调节作用。结果显示,无糖培养条件下AMPK和FLCN表达升高,AMPK磷酸化升高,乳蛋白合成通路重要调节蛋白mTOR表达和磷酸化降低,β-酪蛋白表达降低,乳脂合成相关酶ACC基因和蛋白表达降低。研究结果表明当乳腺上皮细胞能量缺乏时,细胞能量感受器AMPK被激活,抑制合成代谢,同时FLCN表达升高动态调节AMPK活性,抑制细胞凋亡,维持能量缺乏早期细胞存活。上述实验证明FLCN通过AMPK信号通路参与奶牛乳腺上皮细胞的能量代谢调节。综上所述,FLCN促进乳蛋白合成和细胞增殖,抑制细胞凋亡,并且FLCN参与乳腺上皮细胞中AMPK信号通路的调节,FLCN与AMPK之间存在负反馈关系。
【图文】：

差异显著,片段,乳蛋白,乳腺上皮细胞

Ｎｏｔｅ：邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｂ：邋ＣＫ１８邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ；邋ＤＡＰＩ－ｌａｂｅｌｅｄ邋ｎｕｃｌｅｉ邋（ｂｌｕｅ），邋ＦＩＴＣ－Ｉａｂｅｌｅｄ邋ＣＫ邋１８逡逑（ｇｒｅｅｎ）；邋ｓｃａｌｅ：邋３Ｏｆｉｍ逡逑图３－３奶牛乳腺上皮细胞ＣＫ１８鉴定逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＫ１８邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑３．３邋ＦＬＣＮ对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和乳蛋白合成的影响逡逑３．３．１逦ＦＺＣＷ干扰对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和乳蛋白合成的影响逡逑３．３．１．１逦ＦＬＣ７Ｖ最佳干扰片段的筛选逡逑由上海吉玛公司设计并合成ＦＬＣ７Ｖ基因干扰片段转染到ＢＭＥＣｓ中，４８ｈ后收集细胞样品，逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ检测各组样品中ＦＬＣＷｍＲＮＡ表达，筛选出干扰效果最好的片段。结果如图３－４所逡逑示，ｓｉＲＮＡ－２的干扰片段转染后，凡ＣＷｒａＲＮＡ表达低于转染ｓｉＲＮＡ－１和ｓｉＲＮＡ－３干扰片段，逡逑由此表明ｓｉＲＮＡ－２片段为最佳干扰片段可用于后续实验。逡逑２邋１．５－．逡逑！邋°邋ｉ自逡逑ｉ：邋Ｊ邋Ｊ邋ｌｌ逡逑ＣＯＮ邋ｓｉＲＮＡ－１邋ｓｉＲＮＡ－２邋ｓｉＲＮＡ－３逡逑图３－４ＦＬＣ７Ｖ最佳干扰片段的筛选；代表差异显著（Ｐ＜０．０５）；邋“＊＊”代表差异极显著逡逑（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．３－４邋Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｅｓｔ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ邋ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ＦＬＣＮ；邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ逡逑＜０．０５）；“＊＊”邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋

转染效率,乳蛋白,凋亡,转染

３．３．１．２转染ＦＬＣＷ干扰片段逡逑转染ＦＩＣＷ干扰片段并于６ｈ后在荧光显微镜下观察。ＦＬＣＷ干扰片段具有ＦＡＭ绿色荧逡逑光基团，可在显微镜下观察到绿色的荧光，由此可检测转染效率。结果如图３－５所示，视野逡逑中绿色荧光分布广泛，说明转染成功效率较高，可用于后续实验。逡逑图３－５邋ＦＬＯＶ干扰片段的转染效率逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＦＬＣＮ邋ｓｉＲＮＡ逡逑３．３．１．３逦ｑＲＴ－ＰＣＲ检测奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相关基因的表达逡逑实验分为空白对照组（Ｂｌａｎｋ）、阴性对照组（ＮＣ）和／＝ＸＣＷ干扰组（ＦＩＣＷＫＤ）。转染逡逑４８邋ｈ后，，收集细胞样品。ｑＲＴ－ＰＣＲ检测细胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相关基因的表达。实验逡逑结果如图３－６所示，与阴性对照组相比，ＦＬＣＷ干扰后Ｗ：ＣＷ、Ｃ＿ｙｃ／／？Ｄ／和（３－酪蛋白逡逑的ｍＲＮＡ表达降低，说明ＦＩＣ７Ｖ干扰后乳蛋白合成下降，细胞增殖减少。ＪＭＰ尺和逡逑的ｍＲＮＡ表达显著升高，说明Ｆ￡ＣＷ干扰后细胞凋亡增加，尺表达受其调节。实验结果逡逑表明，ＦＬＣ７Ｖ调控乳腺上皮细胞增殖、凋亡和乳蛋白合成。逡逑■Ｈ邋Ｂｌａｎｋ逡逑□邋ＮＣ逡逑２邋１，５１逦ｉｚａ邋ＦＩＸＮ邋ＫＤ逡逑ＩｋｆｌｌＭ逡逑ＦＬＣＮ邋ｍＴＯＲ邋ＡＭＰＫ邋ＣｖｃＩｉｎＤｌ邋｜Ｈ：ａ？ｅｉｎ邋ｃａＭｐａｓｅｉ逡逑图３－６邋ｑＲＴ－ＰＣＲ检测细胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相关基因表达；代表差异显著逡逑（Ｐ＜０．０５）；邋“＊＊”代表差异极显著（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．３－６邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823

【参考文献】