猪肺炎支原体硫辛酸蛋白连接酶的克
发布时间：2020-04-06 07:03
【摘要】：猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支气管肺炎的主要病原,Mhp感染死亡率不高,但感染后定殖到呼吸道纤毛组织,破坏纤毛屏障,易引起多种疾病混合感染,给养猪业带来极大危害。Mhp结构简单,但培养环境相对较为苛刻,难以分离培养,对其深入研究带来极大困难。开展有关猪肺炎支原体代谢的相关研究有助于我们更好的了解其生长机制。硫辛酸(Lipoic acid,LA)是高效抗氧化剂,广泛存在于动物、植物及微生物中,在有机体的能量代谢过程中起着重要作用。LA是生物体能量代谢过程中多种多酶复合物的辅酶,包括α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶以及甘氨酸裂解系统,这些多酶复合物在生物体能量代谢、脂肪酸合成以及氨基酸降解中发挥重要作用。生物体中LA的代谢主要是在相关酶的的催化作用下,以共价键方式连接到一类含有硫辛酸结合结构域(Lipol Domain,LD)的蛋白分子上,该过程又称为硫辛酸修饰。硫辛酸修饰对于微生物的生长代谢至关重要,但仅少数微生物的硫辛酸修饰途径研究较为透彻,对一些物种的研究发现其硫辛酸蛋白连接酶在生物体硫辛酸代谢中发挥重要作用。目前关于猪肺炎支原体硫辛酸蛋白连接酶(Lipoate Protein Ligase,Lpl)的研究还没有相关文献报道。为了分析Mhp中是否存在天然的Lpl,本研究制备了抗Mhp rLpl的多克隆抗体。用制备的多克隆抗体在蛋白质水平检测到Mhp中存在天然的Lpl。然后通过体外反应进行Lpl的功能研究,Western blot实验结果显示Mhp Lpl能够将硫辛酸分子转移至Mhp GcvH上的LD上。进一步对Mhp Lpl的结构功能探究,结合rLpl蛋白晶体结构解析对Mhp Lpl的大小域分别进行克隆表达,并通过体外实验确定其大域能够完成硫辛酸转移过程,小域在硫辛酸催化反应中不能完成硫辛酸转移。为进一步探究Lpl转移硫辛酸至Mhp GcvH上的硫辛酸结合位点,本研究利用定点突变技术对其GcvH上的赖氨酸进行单点突变,将突变成功的重组质粒表达纯化后分别进行体外实验,结果显示第56位赖氨酸为硫辛酸结合位点。综上,本研究首次发现了Mhp上存在Lpl,确定了Mhp Lpl能够完成LA代谢反应,证明了Mhp Lpl大域和小域的功能,同时还发现了Mhp Lpl转移硫辛酸至GcvH的第56位赖氨酸。本研究有助于我们更好的理解Mhp的生长特性及代谢机制,为Mhp硫辛酸代谢相关酶的研究奠定了基础。
【图文】：
有关枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、肺炎链球菌、嗜酸性热源菌、天蓝色链霉菌、牛等的硫辛酸代谢机制的研究也有文献报道，但尚未完全阐明(Cao and Cronan, 2015; Keeney, 2009)。图1.1 大肠杆菌硫辛酸代谢途径Fig.1.1 Lipoic acid metabolism pathways in E.coliA. 外源性LA代谢：硫辛酸在LplA的作用下活化成lipoyl-AMP，活化后的lipoyl-AMP在LplA的作用下将硫辛酰部分转移到LD上；B. 内源性LA代谢：LipB将Oct-ACP的辛酰部分直接转移到E2的LD上，然后在LipA的作用下迅速插入两个硫原子完成硫辛酸内源性代谢反应生成硫辛酰基A. Metabolism of LAprovided in the environment：LAis activated to lipoyl-AMP by LplA，LplAthen transfers thelipoyl moiety on the activated lipoyl-AMP to the LD；B. Metabolism of Endogenous LA：LipB transfers the octanoyl moiety on the octanoyl-ACP to the LD, then LipAcatalyzes two sulfur atoms to insert into the octanoylated domains
图 2.1 a.Mhp lpl 同已知的不同物种硫辛酸蛋白连接酶相似性分析 b.Mhp 168 基因组中 lpl 基因定位Fig. 2.1 a.Homology analysis of Mhp lpl with lipoate protein ligase from other species b.The gene of lpl mappinthe Mhp 168 genome2.3.2 Mhp lpl 基因的克隆与鉴定2.3.2.1 lpl 基因的克隆以 lpl-1F、lpl-1R 为引物，Mhp 的基因组为模板，，通过 PCR 的方法扩增出 Mhp lpl 的基因段，扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小为 1029 bp，同预期结果一致（图 2.2）。图 2.2 lpl 基因 PCR 扩增结果Fig. 2.2Amplification of lpl by PCRM：DL2000 DNAMarker；1：lpl 基因的 PCR 产物M 12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.62
【图文】：
有关枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、肺炎链球菌、嗜酸性热源菌、天蓝色链霉菌、牛等的硫辛酸代谢机制的研究也有文献报道，但尚未完全阐明(Cao and Cronan, 2015; Keeney, 2009)。图1.1 大肠杆菌硫辛酸代谢途径Fig.1.1 Lipoic acid metabolism pathways in E.coliA. 外源性LA代谢：硫辛酸在LplA的作用下活化成lipoyl-AMP，活化后的lipoyl-AMP在LplA的作用下将硫辛酰部分转移到LD上；B. 内源性LA代谢：LipB将Oct-ACP的辛酰部分直接转移到E2的LD上，然后在LipA的作用下迅速插入两个硫原子完成硫辛酸内源性代谢反应生成硫辛酰基A. Metabolism of LAprovided in the environment：LAis activated to lipoyl-AMP by LplA，LplAthen transfers thelipoyl moiety on the activated lipoyl-AMP to the LD；B. Metabolism of Endogenous LA：LipB transfers the octanoyl moiety on the octanoyl-ACP to the LD, then LipAcatalyzes two sulfur atoms to insert into the octanoylated domains
图 2.1 a.Mhp lpl 同已知的不同物种硫辛酸蛋白连接酶相似性分析 b.Mhp 168 基因组中 lpl 基因定位Fig. 2.1 a.Homology analysis of Mhp lpl with lipoate protein ligase from other species b.The gene of lpl mappinthe Mhp 168 genome2.3.2 Mhp lpl 基因的克隆与鉴定2.3.2.1 lpl 基因的克隆以 lpl-1F、lpl-1R 为引物，Mhp 的基因组为模板，，通过 PCR 的方法扩增出 Mhp lpl 的基因段，扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小为 1029 bp，同预期结果一致（图 2.2）。图 2.2 lpl 基因 PCR 扩增结果Fig. 2.2Amplification of lpl by PCRM：DL2000 DNAMarker；1：lpl 基因的 PCR 产物M 12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.62
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本文编号：2616182
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