DMRT1调控山羊雄性生殖干细胞分化、自我更新的机理

发布时间：2020-04-06 17:32

【摘要】：雄性生殖干细胞(male germ stem cell,mGSCs),同样被称作精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是位于睾丸曲细精管基底膜上,既能通过自我更新维持自身群体数量的稳定,又能在体内定向分化并最终形成精子的一类成体干细胞。雄性生殖干细胞可以作为研究精子发生、减数分裂调控和细胞重编程的一个理想体外模型。Double sex and mab-3 related transcription factor 1(DMRT1)基因编码的蛋白质包含一个double sex/mab-3结构域,无论是在脊椎动物或者无脊椎动物中,这个最保守的结构域都会参与个体的性别决定过程。除此之外,DMRT1参与雄性生殖干细胞的损伤修复、抑制睾丸肿瘤、维持雄性生殖干细胞有丝分裂与减数分裂的平衡并且调控雄性生殖干细胞的多能性。因此,探究DMRT1在雄性生殖干细胞中的功能机制,可以为提高动物遗传育种、动物疾病模型和物种保护提供理论指导。在本研究中我们首次研究了DMRT1对山羊雄性生殖干细胞分化和自我更新过程中的影响,以及DMRT1在睾丸生殖免疫中发挥的功能。实验结果如下:1.DMRT1基因在哺乳动物中广泛存在且不同物种中序列高度保守,多序列比对的结果发现6种哺乳动物的DMRT1基因序列一致性达到了86.42%。对于其核心结构域DM结构域分析表明,不同物种的氨基酸序列基本一致,说明DM结构域在不同物种中同样具有高度保守性。为了探究DMRT1在山羊不同组织的表达情况,免疫荧光染色结果表明DMRT1在山羊睾丸中特异表达。染色及定量PCR进一步发现DMRT1在1月龄山羊睾丸的表达量很低,3月龄睾丸起始减数分裂后DMRT1表达明显上调,至个体成熟其表达水平趋于稳定。其次,利用免疫荧光共染色揭示了DMRT1主要定位在未分化和分化中的雄性生殖干细胞中,但是在启动减数分裂的精母细胞中却没有表达。根据以上结果,我们认为DMRT1主要在雄性生殖干细胞中发挥功能,对于mGSCs的分化和增殖发挥重要作用。2.FUW-TetO-Dmrt1慢病毒载体配合rtTA辅助质粒转染雄性生殖干细胞及永生化的mGSCs-I-SB细胞系,筛选出最适诱导DMRT1表达的Dox浓度。EDU、双荧光素酶检测、免疫荧光染色、Western blotting、及定量PCR进一步揭示DMRT1对于山羊雄性生殖干细胞发育过程的功能。在1μg/mL Dox诱导条件下,雄性生殖干细胞增殖能力及分化水平显著增高,减数分裂相关标记相应下调。维甲酸引起雄性生殖干细胞的减数分裂,但过表达DMRT1抑制减数分裂的发生同时mGSCs的增殖标记PCNA及分化标记c-KIT表达上调。因此DMRT1一方面促进雄性生殖干细胞的增殖和分化,另一方面抑制由RA引起的减数分裂异常起始,从而维持精原细胞有丝分裂和减数分裂的平衡。3.DMRT1在睾丸生殖免疫中发挥重要功能,DMRT1通过抑制TLRs信号通路从而降低雄性生殖干细胞中炎症反应的发生。shRNA干扰睾丸雄性生殖干细胞中DMRT1的表达,转录组测序及免疫组化试验结果显示mGSCs中TLR4及NF-κB被激活。ELISA及Western blotting检测发现雄性生殖干细胞内促炎因子TNFα及IL-6的表达上调。免疫共沉淀及双荧光素酶检测试验进一步揭示DMRT1招募PLZF蛋白,二者共同抑制TLR4和NF-κB的转录并促进雄性生殖干细胞数量的回补。与此同时,TUNEL染色及流式细胞术发现DMRT1抑制由炎症反应引起的雄性生殖干细胞的凋亡。综合以上结果表明DMRT1在促进雄性生殖干细胞自我更新及维持睾丸内环境稳态中的重要功能,提供了治疗睾丸生殖缺陷疾病的新思路。4.白消安处理的小鼠睾丸表现出严重的生殖细胞损伤,过表达DMRT1显著恢复了雄性生殖干细胞的数量并且维持精子发生的正常进行。免疫荧光染色及ELISA检测的结果表明DMRT1促进雄性生殖干细胞增殖标记PCNA、VASA及自我更新相关标记PLZF及CSF1R的表达。同时mGSCs自我更新相关的细胞因子GDNF、CSF1表达上调,从而证明DMRT1对睾丸内环境的重建至关重要。基于双分子荧光互补技术(BiFC)和免疫共沉淀检测,最终确认DMRT1蛋白与PLZF蛋白互作主要是由DMRT1与PLZF的BTB结构域互作来实现的。所以DMRT1与PLZF发挥协同作用参与雄性生殖干细胞自我更新下游通路的调节。除此之外,DMRT1和PLZF作为抑炎因子有效地抑制曲细精管内炎症的发生,为雄性生殖细胞损伤的修复建立了良好的微环境。综上所述,我们首次探究了DMRT1在雄性生殖干细胞中的表达模式,探索了DMRT1对山羊雄性生殖干细胞分化和自我更新过程的影响,并揭示DMRT1在生殖免疫中发挥的功能。基因修饰载体转染山羊雄性生殖干细胞,体内体外综合分析、验证筛选DMRT1可能作用的特异靶基因及其互作机制,为研究山羊雄性生殖干细胞的自我更新、精子发生的机理提供新的科学依据;为高产优质家畜的遗传、繁育和不育症的防治提供新方案。
【图文】：

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图 1-1 PGCs 向精子细胞分化示意图 (Griswold et al. 2013)。 1-1 The pattern of PGCs differentiate into sperm cells (Griswold et al. 20殖干细胞微环境研究进展生殖干细胞与微环境干细胞与其生存的周围环境被称为雄性生殖干细胞微环境1-2A)，这个微环境主要包括曲细精管基底膜、支持细胞、管管内皮细胞、细胞外基质以及细胞分子等 (Bhang et al. 20胞主要定位在曲细精管基底膜上，受多种基因的调控和内因此这个微环境构成了调控雄性生殖干细胞自我更新与分2018; Dadoune 2007)。

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图 1-1 PGCs 向精子细胞分化示意图 (Griswold et al. 2013)。Fig 1-1 The pattern of PGCs differentiate into sperm cells (Griswold et al. 2013).1.2 雄性生殖干细胞微环境研究进展1.2.1 雄性生殖干细胞与微环境雄性生殖干细胞与其生存的周围环境被称为雄性生殖干细胞微环境或雄性生殖胞龛 (图 1-2A)，这个微环境主要包括曲细精管基底膜、支持细胞、管周肌样细胞质细胞、血管内皮细胞、细胞外基质以及细胞分子等 (Bhang et al. 2018) (图 1-2B性生殖干细胞主要定位在曲细精管基底膜上，，受多种基因的调控和内分泌及旁分号的调节。因此这个微环境构成了调控雄性生殖干细胞自我更新与分化的强大系Bhang et al. 2018; Dadoune 2007)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827

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