猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗原位点的串联表达及免疫效果评价

发布时间：2020-04-09 01:06

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、高度的肠道传染性疾病,其特征为哺乳仔猪严重水样腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。本研究测定PEDV-HN13株S基因全序列,并对S1基因中具有多个抗原表位的区域进行串联,分别进行原核表达和真核表达,最后对两种蛋白作体液免疫效果的评价。具体研究内容如下:1.PEDV-HN13株S基因全序列分析根据PEDVCV777 S基因设计了 3对相互重叠的引物,以扩增PEDV-HN13株S基因全序列。利用RT-PCR扩增技术,获得目的基因,然后将其连接到pGEM-TEasy载体中;转化DH5α感受态细胞中。对阳性克隆进行测序,确定各片段的序列后拼接出S基因全序列。将PEDV-HN13株S基因全序列与其他国内外的24株PEDVS基因序列进行比较,并使用MEGA5.0软件绘制系统进化树。结果表明,25株PEDV可分为两个基因群即G I群和GⅡ群:GⅠ群主要由经典毒株组成,GⅡ群主要是由近年来的变异毒株组成,而PEDV-HN13 属于 G Ⅰ 群。2.PEDV部分S1抗原位点基因串联的原核表达通过生物信息学分析PEDV-HN13株S1蛋白,选取抗原性较强表位集中的两个区域,针对这两个区域设计2对引物,利用重叠延伸PCR技术扩增出串联基因,命名为PEDV-S1-F;将F基因克隆进pGEM-TEasy载体,通过测序分析显示与原始序列相一致。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,获得重组表达质粒pGST-PEDV-S1-F,并在BL21感受态细胞中诱导表达。经1PTG诱导后,成功表达重组蛋白,蛋白的大小为36KD。经过SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,目的蛋白存在于上清中。使用GST纯化试剂盒进行纯化获得条带单一、纯度高的重组蛋白。3.PEDV部分S1抗原位点基因串联的真核表达含有正确串联基因序列的阳性质粒与真核表达载体pFast-Bac-HTA分别进行双酶切,经胶回收后连接。连接产物转化DH5α感受态细胞,获得重组质粒pFast-PEDV-S1-F;并将其在DH10Bac感受态细胞中转座,经蓝白斑筛选和纯化,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-PEDV-S1-F。将PCR鉴定正确的阳性质粒转染到Sf9昆虫细胞中,27℃培养7天左右收获病毒,经过三次的病毒增殖,获得高滴度的重组杆状病毒。经过IFA、SDS-PAGE和Western-blot分析重组rBac-PEDV-S1-F杆状病毒,结果证明,重组rBac-PEDV-S1-F杆状病毒在Sf9昆虫细胞中得到了表达。4.两种不同系统表达的蛋白的免疫效果评价制备S1-F重组蛋白免疫原及表面展示S1-F重组杆状病毒的细胞性免疫原免疫Balb/c小鼠,首免后间隔14d免疫小鼠,共免疫三次。分别在首免后14、28和42d采集小鼠血清。通过间接免疫荧光、微量细胞培养中和实验对免疫原刺激小鼠产生的体液免疫进行检测。结果表明,pGST-PEDV-S1-F蛋白免疫血清中存在特异性抗体,抗体效价达到1:200,并具有一定的中和能力,中和效价达到1:8。而rBac-PEDV-S1-F重组杆状病毒,抗体效价达到1:800,并具有一定的中和能力,中和效价也达到1:8。本研究将PEV-HN13 S1蛋白的抗原位点串联表达于原核和真核表达系统中,以用于PEDV疫苗的研发,并取得了一定初步成果,为PEDV基因工程疫苗的研发奠定了基础。
【图文】：

１－４所知，ＰＥＤＶ－ＨＮ１３株与ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ－ＣＶ７７７处于同一分支，都属于Ｇ邋Ｉ进化群。逡逑ＰＥＤＶ－ＨＮ１３株属于Ｇ邋Ｉ群，与经疫苗毒株ＣＶ７７７、致弱毒株ＤＲ１３和经典毒株ＣＶ７７７、逡逑ＤＲ１３亲缘关系较近，在遗传进化上存在的距离比较近（图１－４）。逡逑

３．２逦ＰＥＤＶ邋ＳＩ蛋白串联基因片段的ＰＣＲ扩增结果逡逑按照上述ＰＣＲ程序，用ＰＣＲ方法扩增了邋ＰＫ）Ｖ－ＨＮ１３毒株的Ｆ１和Ｆ２基因片段。ＰＣＲ逡逑产物经１％琼脂糖凝胶电泳分析后，图２－２可见大小约为１２３ｂｐ和１３８ｂｐ左右的条带，用逡逑Ｆ１和Ｆ２胶回收产物作模板，ＰＥＤＶ－Ｓ１－Ｆ１和ＰＥＤＶ－Ｓ１－Ｒ２作引物进行扩增，扩增出大小约逡逑为２６１ｂｐ左右的拼接后的条带，与预计大小相符合。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651

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本文编号：2620073