不同抗原型犬细小病毒及其与猫细小病毒分子鉴别方法的建立及初步应用

发布时间：2020-04-09 04:11

【摘要】：犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)和猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)是亲缘关系密切的两种细小病毒,都属于细小病毒科,原细小病毒属,肉食动物原细小病毒1型种的成员。犬细小病毒和猫细小病毒不仅能感染犬科、猫科、鼬科、浣熊科和灵猫科等多种动物,而且引起相似的临床症状;是危害肉食动物健康最严重的烈性传染病病原体之一;前者有多种抗原型且二者可混合感染动物,因此单凭临床症状难以做出鉴别诊断,必须借助实验室检测手段确诊。本研究经大量CPV VP2基因序列比对,利用Beacon designer7软件设计两对引物和五条MGB探针。引物CPV-305F/CPV-305R和探针CPV-2-305P(CPV-2)/CPV-2a-305P(CPV-2a)用于区分CPV-2疫苗株和其它抗原型试验;引物CPV-426F/CPV-426R和探针CPV-2-426P(CPV-2/2a)/CPV-2b-426P(CPV-2b)/CPV-2c-426P(CPV-2c)用于区分CPV-2a(2)、CPV-2b和CPV-2c抗原型试验。通过这两个单独的多重TaqMan real-time PCR试验可以有效的检测和区分CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c四种抗原型CPV。该检测方法可检测10~1个拷贝的CPV-2,CPV-2a和CPV-2b重组质粒,10~2个拷贝的CPV-2c重组质粒;特异性试验表明本方法适合于CPV的检测,而和犬瘟热病毒、犬腺病毒和冠状病毒等均无交叉反应性;本方法经临床初步应用,并与PCR测序方法检测结果进行对比,显示两者检测结果符合率为100%。结果表明本研究成功建立了一种多重TaqMan real-time PCR检测方法,该方法能够用于检测和区分CPV四个抗原型,并可定量测定CPV DNA。本研究利用qPCR-HRM试验分析可检测单核苷酸多态性位点(SNP)和序列碱基组成变化的优势,依据FPV和CPV的SNP A4408C位点,设计一对引物,进化qPCR扩增;扩增完成后的数据用Applied Biosystems?High Resolution Melt Software v3.1软件自动分析;结果表明该方法能同时检测感染动物粪便中的CPV或FPV DNA。特异性试验表明本方法和犬瘟热病毒,犬腺病毒和犬冠状病毒等无交叉反应;敏感性试验表明该方法最低可以检测到4.2个拷贝的CPV和FPV的重组质粒;为评估本方法的可行性,80个疑似细小病毒感染临床样品用于该方法和PCR-测序以及病毒分离等试验的平行分析,结果证明,该方法和基因测序以及病毒分离等方法符合率高,其符合率分别是96.25%和85%。本研究成功建立了一种能够同时检测和区分CPV和FPV的诊断方法。
【图文】：

农业科学院硕士学位论文 第氨酸突变为丝氨酸或天冬氨酸后，则失去了与 CPV 和 FPV 结合的能力，将该位，则失去与 FPV 结合的能力。病毒进入细胞内，，形成核包体，从核包体中释放进入到细胞质中。细小病毒粒子为 25nm，因此细小病毒可依靠其衣壳蛋白上存在的核内定位信号，使得病毒粒入细胞核内（Harbisonetal.,2008）。研究报道，病毒进入核孔的过程中，由于内体的结构会发生一些可逆变化（Farr et al., 2005）。病毒进入核内后，在宿主的 DNA 复制酶发挥作用下，以 3’端-OH 基因团作为复碱基配对的原则，将其基因组的单股 DNA 复制成双股 DNA。宿主的 RNA 聚合病毒基因则开始转录为 mRNA。mRNA 经可变剪切作用，产生了两类不同长度的 mRNA 编码非结构蛋白，较短的编码结构蛋白。最后，病毒的组装要先形成前体需要多个结构蛋白组建在一起。然后在非结构蛋白的作用下，使双链 DNA 变成单链 DNA 进入到前体衣壳中，最终病毒组装形成完整的病毒粒子被释放。

V LN15-32；2：CPV JL14-1；3：CPV BJ14-1；4：CPV B 2.1 CPV VP2 基因 PCR 扩增产物凝胶电泳结果el electrophoresis result of amplification of CPV V，对挑取的菌落进行 PCR 和测序鉴定，同时表明成功构建了用于 TaqMan real-time P为 pCPV LN15-32，pCPV JL14-1，pCP LN15-32；2：pCPV JL14-1；3：pCPV BJ14-1；4：pCPV图 2.2. 重组质粒菌落 PCR-电泳鉴定图
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】

相关期刊论文 前7条

1 林鹏;赵航;王建科;程悦宁;任静强;易立;仝明薇;程世鹏;;犬细小病毒的分离鉴定及其VP2基因序列分析[J];中国畜牧兽医;2015年10期

2 马爱民;李倩;王超;赵国星;程楠;金宏丽;曹增国;赵永坤;郑学星;高玉伟;王化磊;杨松涛;;血凝-血凝抑制试验在快速诊断犬细小病毒性肠炎中的应用[J];中国兽医学报;2015年06期

3 马爱民;胡桂秋;朱晓文;黄靖;梁萌;李斌;高玉伟;王化磊;杨松涛;夏咸柱;;猪红细胞醛化及其在犬细小病毒血凝试验中的应用[J];黑龙江畜牧兽医;2014年03期

4 胡大勇;侯建民;罗颖辉;汪滢滢;罗罡;李延族;吴吉广;;犬细小病毒病的诊治[J];经济动物学报;2012年04期

5 艾静;袁玉国;彭秋玲;艾妮丝;;犬细小病毒病的流行病学调查[J];中国畜牧兽医;2012年11期

6 刘忠华,钟翎,贺星亮,徐耀基,黄韧;用PCR技术鉴定犬细小病毒弱毒疫苗株[J];中国兽医学报;2003年05期

7 赵永军,童光志,赵奕,白丽萍,殷震;肉食兽细小病毒核酸探针的制备及其初步应用研究[J];兽医大学学报;1990年01期

相关博士学位论文 前2条

1 王建科;肉食动物细小病毒流行株分子特征与致病性分析[D];中国农业科学院;2016年

2 嘎利兵嘎;高分辨率熔解曲线（HRM）技术在动物病毒基因分型中的研究及应用[D];中国农业大学;2015年

相关硕士学位论文 前3条

1 陈月平;犬细小病毒乳胶凝集快速检测方法的建立和应用[D];华中农业大学;2013年

2 高丽;犬细小病毒单克隆抗体的制备及初步应用[D];吉林大学;2009年

3 雍海平;猫细小病毒间接ELISA方法的建立及灭活疫苗毒株筛选[D];吉林大学;2008年

本文编号：2620274