槲皮素对过氧化氢与脂多糖暴露下猪小肠上皮细胞的保护作用

发布时间：2020-04-09 22:18

【摘要】：养殖过程的断奶应激、严重的环境异常刺激或者中毒等对猪肠道健康有重要的影响,如诱发肠道氧化损伤与炎性反应,进而降低猪的生长性能,给养猪业带来巨大的经济损失。因此,将低毒性、无有害残留的天然产物分子开发为保护猪肠道的兽药或饲料添加剂具有重要的意义。槲皮素(Quercetin,Que)是一种常见的黄酮类物质,在人与小鼠等多种模式细胞中表现出抗氧化、抗炎等生物活性,但是目前没有关于其对猪肠道健康调控方面的详尽报道。所以,本试验拟探究Que对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖的影响,并采用过氧化氢(H_2O_2)和脂多糖(LPS)在体外建立氧化损伤和炎症反应模型,探究Que对模型条件下猪小肠上皮细胞保护作用及其可能的机制。本研究采用紫外分光光度法确证Que含量,并采用细胞形态比对法与免疫荧光法对IPEC-J2细胞形态进行初步鉴定;以MTT法、流式细胞术、Real-time PCR检测Que对IPEC-J2增殖的影响,并以细胞划痕试验检测Que对IPEC-J2损伤修复的影响;MTT法检测Que处理H_2O_2暴露下细胞的活力变化,2,4-二硝基苯肼法检测细胞上清LDH活力,镜下观察细胞形态;采用流式细胞术检测Que处理H_2O_2暴露下细胞的凋亡率、细胞周期、胞内ROS水平和△ψm变化,Western-blot检测凋亡相关蛋白的相对表达量;比色法检测Que对低程度氧化损伤的细胞MDA含量与SOD、CAT活力的影响,采用Western-blot检测Claudin-1、Occludin蛋白相对表达量;MTT法检测Que处理LPS暴露下细胞的活力变化,镜下观察细胞形态,Griess法检测细胞培养上清NO含量,Real-time PCR检测IL-6和IL-8的mRNA相对表达量。结果显示:Que供试药平均含量为97.97%,细胞形态呈圆梭形、卵圆形,与已报道的IPEC-J2细胞形态基本一致,细胞中存在CK-18蛋白表达。1.25μg/mL至5μg/mL Que在24 h内显著提高IPEC-J2细胞活力,9 h时其促进增殖作用最明显,5μg/mL Que作用细胞24 h可推进细胞进入S期,抑制P27和P21 mRNA的相对表达量,但不能促进细胞划线后的损伤修复。Que预处理2 h、375μM H_2O_2暴露22 h,Que预处理20 h、750μM H_2O_2暴露4 h,Que与375μM H_2O_2共同处理24 h,Que预处理3 h、750μM H_2O_2暴露1 h、2 h与4 h,Que预处理3 h、1000μM H_2O_2暴露4h,皆能显著提高因H_2O_2暴露而降低的IPEC-J2细胞活力;Que预处理能明显改善750μM H_2O_2诱导的细胞形态异常变化,抑制细胞LDH的释放。Que预处理显著降低H_2O_2暴露后的细胞凋亡率,降低G0/G1细胞比例,升高S期与G2/M期细胞总比例,抑制ROS的产生,升高△ψm,降低Bax/Bcl-2比值。Que预处理3 h显著降低低程度氧化损伤(750μM H_2O_2暴露2 h)后的胞内MDA含量和SOD活力,对CAT活性以及Claudin-1、Occludin蛋白相对表达量无显著影响,但对Claudin-1、Occludin蛋白表达具有轻微的上调作用。1μg/mL至10μg/mL的LPS对IPEC-J2细胞活力无明显影响,而Que显著升高LPS暴露下的细胞活力;Que与LPS对IPEC-J2细胞上清中NO含量无影响,但Que可抑制LPS暴露下IL-6与IL-8的mRNA相对表达量。本试验表明Que供试药含量高,试验所用细胞系属于上皮细胞且与已报道的IPEC-J2形态基本一致。低浓度Que可以促进IPEC-J2增殖,其增殖作用与推进细胞由G1期进入S期以及抑制P21、P27基因表达有关,但不具有划线损伤修复功能。Que在不同处理时间下均可减少H_2O_2所致的细胞死亡。Que降低H_2O_2所致的IPEC-J2细胞凋亡率与G0/G1细胞比例,抑制内源性凋亡途径。Que能调节H_2O_2低程度损伤下细胞内氧化还原系统,低程度损伤下细胞的屏障蛋白Claudin-1、Occludin表达无明显变化,而Que对其可能具有潜在的上调作用。Que抑制LPS诱导下的IPEC-J2炎性反应,降低LPS诱导下的IPEC-J2促炎因子基因表达,其机制与NO途径无关,可能与其他通路有关,具体的通路有待深入研究。因此,Que对体外的猪小肠上皮细胞增殖具有促进作用,且可缓解细胞的氧化损伤与炎性反应。
【图文】：

湖南农业大学硕士学位论文为阴性，不会诱导小鼠骨髓细胞与精子发生突变。陈鸿雨等 (2015)对 Q行了急性毒性试验，发现 6 g/kg Que 不会导致大鼠死亡，剖检也未见明且在其亚急性毒性试验中的血常规、血液生化指标以及组织形态学等均常。Utesch et al. (2008) 也表明 Que 在大鼠体内不会产生遗传毒性。但) 却通过体外试验发现 Que 对鼠肺成纤维细胞有致突变性。国家食品药品 (2017) 也发布了最新的世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单，Q类致癌物，该类致癌物的划分依据为“对人类致癌性可疑，但尚无充分的据”。体外试验因缺乏动物机体完善的调节机制，因此没有确切的动物撑，就此判定 Que 存在安全风险的证据仍然不够充分。所以，基于现今评价试验，在合理剂量范围内，可以认为 Que 的安全性较高。

湖南农业大学硕士学位论文猪肠道除了能够消化和吸收营养物质，还能进行物质代谢与免疫调节等可见其健康与生长性能密切相关。养殖过程的断奶应激、严重的环境异常毒等对猪肠道健康影响较大，往往会诱发氧化损伤和炎性反应，轻则降低能，重则还可导致猪只死亡，给养猪业带来经济损失。而 Que 作为植物源子含有多个羟基，，具有较好的清除自由基与抑制炎性反应的活性。但迄今在猪氧化损伤和炎症反应上的研究鲜见，特别是关于猪小肠或其细胞层面所以，Que 对猪肠道是否具有保护作用还没有详尽的证据。见图 1-2。本研究选题目的与意义
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

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本文编号：2621334