Caspase依赖的DDX21切割调控抗病毒先天性免疫机制研究

发布时间：2020-04-10 06:26

【摘要】：DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶,DDX21是DEAD box家族的一员,在正常细胞中主要位于细胞核的核仁中,对细胞RNA加工过程具有重要的作用。此外,DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。在来源于骨髓的树突状细胞(myeloid dendritic cells,mDCs)细胞中,DDX21通过作用于DDX1-DDX21-DHX36-TRIF通路来调控天然免疫。登革热病毒感染后DDX21能够从细胞核迁移进入细胞质进而调控机体的免疫应答。然而,对于DDX21具体如何调控抗病毒天然免疫机制尚不可知。为了探究DDX21调控抗病毒天然免疫的新机制,我们展开以下研究:一、DDX21调控病毒刺激所诱导干扰素的产生。为了观察DDX21在抗病毒免疫应答的功能,沉默DDX21基因后感染病毒,以Western blot、TCID_(50)、ELISA和RT-PCR方法鉴定DDX21基因的缺失对病毒复制和干扰素产生的影响,结果表明:DDX21的沉默能够促进干扰素的产生并且抑制病毒的复制。但是DDX21的过表达对干扰素的产生和病毒复制没有显著影响。二、DDX21在病毒的作用下能够发生切割。为了研究DDX21在病毒感染后蛋白表达的变化,用不同的细胞感染不同的病毒或使用核酸模拟物刺激细胞,以Western blot方法检测,结果表明:内源性和外源性的DDX21在病毒感染和核酸模拟物刺激后均能够发生切割。三、病毒感染通过Caspase-3/6途径切割DDX21。为了探究DDX21的切割机制,首先利用抑制剂处理病毒感染的细胞。结果显示:Caspase抑制剂z-VAD-FMK能够显著抑制DDX21的切割,通过构建一系列DDX21的缺失和突变真核表达质粒,证实DDX21 126位天冬氨酸为其切割位点。通过对其切割位点序列的分析及基因敲除实验验证,证实Caspase-3/6参与了病毒感染诱导的切割DDX21切割。四、DDX21切割后能够从细胞核迁移至细胞质中。为了观察DDX21在发生切割后是否影响其定位发生变化,以激光共聚焦的方法检测病毒感染后DDX21的定位,证实DDX21在病毒感染后从细胞核迁移到细胞质中,进一步结果证实DDX21的转位依赖于切割。五、DDX21切割抑制抗病毒先天性免疫通路。为了探究DDX21切割对先天性免疫通路的影响,通过比较DDX21切割与不切割对干扰素产生的影响,结果表明:DDX21切割抑制病毒感染和poly(I:C)诱导的干扰素的产生及下游干扰素刺激基因的表达。六、DDX21 C端结构域结合双链RNA。为了进一步地探究DDX21的切割如何调控干扰素的产生,利用CO-IP和RNA pull down方法检测DDX21与其自身和RNA的互作,结果显示DDX21能够通过其C端结构域与自身和双链RNA互作。本论文证明DDX21在抗病毒天然免疫中发挥重要的调控作用,更重要的是首次发现DDX21在病毒的作用下发生切割且能够发生迁移,通过与RNA结合调控抗病毒天然免疫。这为进一步的研究DDX21调控抗病毒天然免疫提供理论依据。
【图文】：

Lasko et al. 1989)。研究结果表明p68、SrmB、MSS116、vasa、PL10、哺乳动物的eIF4A、酵母eIF4A这些蛋白均参与RNA代谢并且具有相似的序列，这些序列为Q-基序、基序1、基序1a、基序1b、基序I、基序II、基序III、基序IV、基序V、基序VI（图1-1）(Linder, Lasko et al. 1989)。其中基序II包含Walker B 基序和D-E-A-D (Asp-Glu-Ala-Asp)氨基酸序列，因而将其命名为DEADbox (Silverman, Edwalds-Gilbert et al. 2003)。Q-基序、基序1、基序II、基序IV可以结合ATP导致水解的发生。而基序1a、基序1b、基序III、基序IV和基序V可以发生分子内的重排和RNA互作(Tanner,Cordin et al. 2003)。图 1-1 DEAD box 家族的基序fig.1-1 Motifs within the DEAD Box FamilyFrom Wikimedia Commons

干扰素,病毒复制,刺激因子

毒滴度近乎一致)。因此初步认为，DDX21 基因的沉默抑制 VSV 的复制。对于 DDX21 的沉默抑制病毒复制，，可能是由于干扰素的产生抑制病毒的复制。为了证明这个假设，以 ELISA 检测细胞上清IFN-β的水平(图2-1 C)，与对照组相比发现在感染病毒后实验组IFN-β的含量明显的增多。为了验证上述的实验结果，以荧光定量 PCR 检测细胞内的 IFN-β 和干扰素下游刺激因子( interferon-stimulated gene, ISG)的转录水平，结果与 ELISA 一致(图 2-1 D-F)，DDX21 的沉默促进干扰素及干扰素下游刺激因子的产生。因此，得出结论 DDX21 的沉默抑制 VSV 的复制并促进干扰素的产生。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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