化脓隐秘杆菌溶血素激活巨噬细胞NF-κB系统机制的研究

发布时间：2020-04-10 18:55

【摘要】：化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种常见于动物呼吸道、消化道黏膜和乳房的共生性细菌。同时,T.pyogenes也是一种条件性致病菌。当动物处于应激性状态下时,T.pyogenes能引起动物发生多种炎症疾病。化脓隐秘杆菌溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes分泌的唯一一种溶血素,是一种胆固醇依赖性溶细胞素(Cholesterol-dependent cytolysin,CDCs),也是一种成孔毒素(Pore-forming toxin,PFT)。已有研究表明,PLO接种小鼠可以引发炎症。但是,PLO导致炎症的机制仍不明确,而阐明其引发炎症的机制对于全面揭示T.pyogenes的致病机制有一定的积极意义。本研究表达纯化了重组PLO(Recombinant PLO,rPLO)、突变体蛋白rPLO W497F和rPLO D238R,以及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F,并对它们的溶血活性进行分析。结果表明rPLO的溶血活性最强,其次为rPLO D238R,rPLO W497F及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F几乎没有溶血活性。用不同浓度的重组蛋白处理J774A.1细胞检测细胞毒性结果表明,rPLO蛋白在30-60 ng/mL浓度范围内细胞毒性较低,而随着浓度的增加细胞毒性逐渐增强;突变体蛋白rPLO W497F及rPLO D238R几乎不表现细胞毒性。重组蛋白处理与钙离子(Calcium,Ca~(2+))荧光探针孵育的J774A.1细胞,结果表明亚裂解剂量rPLO处理的细胞内Ca~(2+)浓度下降,rPLO D238R和rPLO W497F处理的细胞中Ca~(2+)浓度显著高于rPLO处理的细胞。用含有不同浓度Ca~(2+)的细胞外液与rPLO共处理细胞,结果表明当细胞外液中含有1 mmol/L Ca~(2+)时,rPLO处理可以导致细胞中的Ca~(2+)浓度下降;当细胞外液中Ca~(2+)浓度低于正常浓度时,rPLO作用可以导致细胞中的Ca~(2+)浓度上调。用不同浓度的rPLO处理J774A.1细胞0.5 h,检测表明30-60 ng/mL的rPLO对细胞钙蛋白酶(Calpain,CAPN)的活性没有明显的影响,当时间延长至2 h时,细胞内CAPN活性被显著地抑制。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,western-blot检测表明rPLO可以显著抑制NF-κB p65的磷酸化及NFATc1的表达,并且处理细胞0.5 h就能表现显著的抑制效果;rPLO D238R和rPLO W497F处理组的细胞中NF-κB p65的磷酸化水平及NFATc1的表达有所上调。用亚裂解剂量的rPLO与不同浓度Ca~(2+)外液共同处理J774A.1细胞,结果表明在含有1 mmol/L CaCl_2的RPMI1640培养基中,由rPLO导致的细胞中NF-κB p65磷酸化水平降低的现象有所缓解,NFATc1的表达水平上调。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,检测细胞中非经典NF-κB信号通路中几个关键性蛋白,结果表明在0.5 h时NIK及p52的含量增加,p100与IKKα/β的磷酸化水平提高。用不同重组蛋白处理小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs),检测细胞中钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CN)的活性,结果表明所有重组蛋白均不会显著影响细胞中CN活性。用不同蛋白处理BMDMs,结果表明rPLO可以刺激细胞产生大量的IL-1β;rPLO W497F及rPLO D123可以刺激细胞产生大量的IL-10。然后用重组蛋白刺激tlr4基因缺失的BMDMs(BMDMs~(tlr4-)),结果表明rPLO仍可刺激细胞产生大量的IL-1β;而rPLO W497F和rPLO D123对IL-10诱导能力由于tlr4基因的缺失受到完全抑制。用PLO蛋白D123结构域的截短多肽处理BMDMs,结果表明rPLO 95-156可以上调BMDMs中IL-10的大量表达。综上所述,本实验证明了PLO作用巨噬细胞(Macrophages,Mφ)可以通过两种方式影响NF-κB信号通路。当PLO维持完整的结构和功能时,可以通过“成孔活性”激活非经典NF-κB信号通路;而在细胞膜结合功能受损的情况下,PLO表现“PAMPs样活性”通过刺激MφTLR4活化经典NF-κB信号通路,介导细胞因子的表达。本研究为全面理解T.pyogenes导致感染性炎症的机制提供部分理论依据。
【图文】：

氨基酸序列,氨基酸,结构域,胆固醇

免疫细胞例如中性粒细胞和巨噬细胞也有溶解作用[13]。有研究证实接种 PLO 可以造成实验动物皮肤溃烂和死亡，并且证实了无论通过何验动物的血浆中均能检测到抗溶血素的抗体，因此可以证明 PLO 可以胆固醇依赖性溶细胞素（Cholesterol-Dependent Cytolysins, CDCs）家还包括单核增生李斯特氏菌溶血素（Listeriolysin, LLO）、肺炎链sin, PLY）、中间链球菌溶血素（Intermedilysin, ILY）、猪链球菌溶血气荚膜梭菌溶素 O（Perfringolysin O, PFO）等。氨基酸序列分析结s 家族的成员，但在许多方面都是独一无二的。它的氨基酸序列与序列同源性只有 31%-41%[15]；它的十一肽基序与其 CDCs 家族成员DCs 不同的是 PLO 的溶血活性对还原剂或硫醇阻断剂都不敏感。有相当保守的三维结构，由四个富含β折叠的结构域组成，分别命名构域，其中 D4 结构域位于蛋白的羧基端，含有特殊的十一肽基序，，并与细胞膜上胆固醇丰富的区域相互作用，使 PLO 单体锚定在细胞D3 结构域构象发生变化，使蛋白单体发生寡聚化插入到细胞膜中[17]50 nm 的穿膜孔道，使细胞内外渗透压失衡导致细胞溶解死亡，由此成孔毒素（Pore-forming toxins, PFTs）[18]。

经典,信号通路,与非

东北农业大学农学硕士学位论文 MD-2 与 CD14 的介导下可以通过 TLR4，介导下游信号tiation factor 88, MyD88）及肿瘤坏死因子受体相关因子NFR6）的激活，使 NF-κB 活化介导促炎性细胞因子转录[24]。研究发现，在多种急慢性炎症发生发展的过程中，度的激活[25-28]。NF-κB 家族是介导许多促炎性细胞因录的关键性蛋白质。NF-κB 家族共有五个成员，包括：N）、RelA（p65）、RelB 以及 c-Rel。其中 RelB 以及 c- Rel 结构域（Rel homology domain, RHD），RHD 的功与 DNA 特异序列的结合，具有核定位的作用[29]，p65激活结构域（Transcription activation domain, TAD），可活的关键分子不同 NF-κB 信号通路分为两种，一为经κB pathway），二为非经典的 NF-κB 信号通路（Non-canon
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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