鸭疫里默氏杆菌gldL基因缺失株的构建及培养上清中免疫原性蛋白的鉴定

发布时间：2020-04-12 05:35

【摘要】：鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipesifer,RA)是主要侵害鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种接触性传染病。本病在世界各地广泛分布,具有较高的发病率和死亡率,是当前严重危害养鸭业的主要传染病之一。随着对细菌毒力因子的深入研究,细菌分泌系统在细菌致病性相关研究中发挥着重要作用。近年来,随着Ⅸ分泌系统(T9SS),又称为Por分泌系统在拟杆菌门成员中的发现,在GenBank上已公布的全基因组序列的鸭疫里默氏杆菌基因组中均存在完整的T9SS核心组分,研究该分泌系统在细菌与宿主的相互作用以及细菌的致病过程中的作用就尤为值得关注。本研究构建获得鸭疫里默氏杆菌Yb2株Ⅸ型分泌系统核心组分gldL的基因缺失株以及gldL-gldN基因双缺失株,并对缺失株进行了生物学特性分析。此外采用2-D蛋白质组合Westerm Blot等方法对Yb2株培养上清中具有免疫原性的蛋白进行了鉴定。1.鸭疫里默氏杆菌Yb2株gldL和gldL-gldN基因缺失株的构建及其生物学特性研究本研究通过扩增gldL基因左、右同源臂连入自杀质粒313,通过结合转导的方法导入鸭疫里默氏杆菌野生株Yb2,构建获得gldL基因缺失突变株Yb2△gldL;通过结合转导的方法导入鸭疫里默氏杆菌Yb2△gldN基因缺失突变株,构建获得gldL-gldN基因双缺失突变株Yb2△gldL-gldN。然后将野生株Yb2的gldL基因ORF与构建的大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭表达质粒pRES1相连接,通过接合转导的方法将重组质粒pRES1-gldL导入缺失株Yb2△gldL中,获得回复株cYb2△gldL。生物学特性分析的结果表明,与野生株Yb2相比,缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回复株cYb2△gldL的生长曲线无显著性差异;另外通过蛋白酶水解试验表明:缺失株Yb2△gldL和Yb2△gldL-gldN在含有脱脂乳的TSA平板上培养24h后无蛋白酶水解能力,通过雏鸭致病性分析以动物实验LD50的测定结果显示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN与野生株Yb2相比对雏鸭的LD50分别升高了 48、110倍左右;通过肝脏、脑、血液细菌载量的测定结果显示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回复株cYb2△gldL感染雏鸭体内肝脏、脑的细菌载量均比野生株Yb2显著性降低,表明缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN对组织的侵袭力下降。因此,以上结果证实gldL和gldL-gldN基因的缺失使Ⅸ型分泌系统的功能受损,从而使鸭疫里默氏杆菌对雏鸭的致病性降低。2.鸭疫里默氏杆菌Yb2株培养上清中免疫原性蛋白的鉴定采用TCA沉淀法在Yb2株上清液中加入10%的TCA,在酸性条件下从培养上清中鉴定到了 12种鸭疫里默氏杆菌Yb2株培养上清中具有免疫原性的蛋白。原核表达了 3种具有免疫原性的蛋白P1、P2和P3,经免疫雏鸭后攻毒试验,结果表明:P1蛋白对雏鸭抵御鸭疫里默氏杆菌感染具有一定的免疫保护性。为本研究鸭疫里默氏菌病新型疫苗的研制打下了基础。
【图文】：

系统主要包括以下１３个编码成分基因：Ｓｏｖ、ＰｏｒＫ、ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＮ、ＰｏｒＰ、ＰｏｒＱ、ＰｏｒＴ、逡逑ＰｏｒＵ、ＰｏｒＶ、ＰｏｒＷ、ＰｏｒＸ、ＰｏｒＹ，其中一些蛋白是通过双组分系统ｐｏｒＸＹ表达的［４４］。结逡逑构模式图（如图１所示），其中细菌的内膜部分有ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＫ，而外膜部分有ＰｏｒＮ、逡逑ＰｏｒＰ、ＰｏｒＺ，ＰｏｒＵ编码的是一种Ｃ端肽酶，牙龈卟啉单胞菌Ｔ９ＳＳ分泌的蛋白绝大多数含逡逑有氨基酸残基，，数量一般保持在７０－８０个Ｃ端结构域ＣＴＤ，当蛋白通过Ｔ９ＳＳ时是蛋白分逡逑泌所必需的结构域；ＰｏｒＵ进行切割，Ｃ端暴露于细胞外环境参与蛋白功能；ＰｏｒＸ、ＰｏｒＹ逡逑分别是反应调节器和传感器激酶，当其缺失后Ｓｏｖ、ＰｏｒＫ、ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＮ、ＰｏｒＰ、ＰｏｒＴ逡逑表达量显著下调［４５４７］。ＰｏｒＺ是近两年才鉴定到的Ｔ９ＳＳ核心组分，它是ＰｏｒＵ定位于细菌逡逑表面及Ｔ９ＳＳ运载蛋白的翻译后修饰所必需的［４８］。逡逑

＝卜■：邋ｊ逡逑Ｉ：：＇，逡逑图１－２质粒３１３－ｇＷＺ－ＬＲ的酶切鉴定逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋３＼３－ｇＩｃ／Ｌ－ＬＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ分子标准量ＤＬ１００００逦１．重组质粒３１３－ｇＷＺ－ＬＲ的酶切结果逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ１００００逦１．邋Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋３１３－ｇＷＩ－ＬＲ邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋ＢａｍＨＩ／ｓｐｈＩ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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本文编号：2624345