延黄牛脂肪细胞转录组学及相关功能基因对成脂分化作用的研究

发布时间：2020-04-12 17:36

【摘要】：牛肉以高蛋白、高不饱和脂肪酸含量等优良品质越来越多的受到消费者的喜爱。随着物质基础和生活质量的提高,消费者对肉质鲜美、口感鲜嫩多汁、大理石花纹多的牛肉的需求日益增多。肌内脂肪沉积是一个涉及了脂肪生成、脂肪降解及脂肪酸转运的动态平衡过程,一旦合成代谢的能力大于分解代谢时候,脂肪沉积增加,而当原始平衡破坏时脂肪沉积则减少。牛肉肌内脂肪的沉积及分布受到如品种、饲养条件、饲料成分等诸多因素的影响,因此利用分子生物学技术从根本上提高胴体质量促进脂肪沉积是一种行之有效的途径。市场上虽然有一些被广泛应用的商品化细胞系,但因其具有种属特异性而无法真实地反映出牛等大型家畜的脂肪合成和代谢的实际调控过程。为了更加深入了解延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,本研究在分离脂肪前体细胞的基础上,建立了体外诱导分化体系,利用RNA-Seq技术对不同分化阶段脂肪细胞进行转录本测序,对筛选获得的候选基因进行了生物信息学分析和体外验证,深入研究了 HTR2A和TRIB3在成脂分化过程中的作用,为进一步研究牛脂肪沉积作用机制和分子育种奠定了基础。具体研究结果如下:1.利用胶原酶消化法分离了延黄牛前体脂肪细胞,并进行了原代和传代培养;用传统的鸡尾酒法对前体脂肪细胞添加了多种诱导因子对其进行诱导分化,对脂肪细胞进行鉴定。结果显示:(1)本研究成功分离了延黄牛前体脂肪细胞;(2)细胞生长状态良好,符合正常的细胞生长规律;(3)经诱导分化后的细胞可被油红O染色,呈现典型的圆形脂滴,具有成熟脂肪细胞的典型特征;(4)甘油三酯含量在早期变化缓慢,在第4天以后显著升高;(5)成脂标志因子PPARγ、C/EBPα随着分化过程的进行,在分化早期显著上升,随着分化进程的结束略有下降。2.通过RNA-Seq技术对延黄牛脂肪细胞的分化前期、分化中期及分化末期进行了转录本测序,结果显示:(1)原始测序数据在过滤后,获得高质量数据,所有这些样品的clean reads的Q20%得分达到90%以上,不同阶段的GC含量(%)皆在51%～53%范围内;(2)在对牛不同分化阶段的差异表达基因分析中,与Day-0相比,Day-4共有2510个DEGs(1277个上调基因和1233个下调基因);与Day-4相比,Day-9共有2446个差异表达基因(811个上调基因和1635个下调基因);(3)GO及KEGG分析发现DEGs富集在2000多个功能术语的类别和超过300个KEGG通路中,对牛不同分化阶段的功能富集分析中发现脂肪细胞分化的早期起到最主要的作用,主要参与染色体有丝分裂等细胞周期进程,分化末期主要是细胞形态的改变,细胞信号通路的富集作用也有一定程度的减弱;(4)采用qRT-PCR的方法随机挑选数个差异表达基因,其定量结果与RNA-seq的结果进行对比分析,qRT-PCR的定量结果与RNA-Seq的结果虽略有差异,但变化趋势大体相同,表明RNA-seq的测序结果真实可靠。3.利用体外表达调控技术对候选成脂促进基因HTR2A的作用机制进行了研究,结果显示:(1)HTR2A过表达组能显著促进成熟脂肪细胞的脂滴及甘油三酯含量,促进成脂关键因子C/EBPα及PPARγ的表达,而HTR2A的干扰组则与其相反,脂滴及甘油三酯含量均显著降低,抑制成脂关键因子C/EBPα及PPARγ的表达;(2)HTR2A过表达组能显著促进Akt信号通路蛋白及Akt信号通路Ser473位点磷酸化蛋白的表达,促进p38 MAPK信号通路蛋白及p38 MAPK信号通路磷酸化蛋白的表达,促进ERK1/2 MAPK信号通路蛋白及ERK1/2 MAPK信号通路磷酸化蛋白的表达,推测HTR2A可能通过调控Akt信号通路、p38MAPK信号通路及ERK1/2 MAPK信号通路从而在促进成脂分化过程中起到重要的作用。4.利用体外表达调控技术对候选成脂抑制基因TRIB3的作用机制进行了研究,结果显示:(1)TRIB3过表达组能显著抑制成熟脂肪细胞的脂滴及甘油三酯含量,而TRIB3的干扰组则与其相反,脂滴及甘油三酯含量升高;(2)TRIB3过表达显著抑制Akt信号通路蛋白及Akt信号通路Ser473位点磷酸化蛋白的表达,促进p38 MAPK信号通路蛋白及p38 MAPK信号通路磷酸化蛋白的表达,促进ERK1/2 MAPK信号通路蛋白及ERK1/2 MAPK信号通路磷酸化蛋白的表达来完成的,推测TRIB3可能通过调控Akt信号通路、p38 MAPK信号通路及ERK1/2 MAPK信号通路在延黄牛的抑制成脂分化过程中起到重要的作用。综上所述,本研究成功分离了延黄牛前体脂肪细胞,在脂肪细胞分化的不同时期进行了转录组学分析,对成脂分化过程中的功能基因HTR2A和TRIB3进行了研究,为加深对延黄牛脂肪分化的机制的理解奠定分子基础,也为肌内脂肪沉积的机理提供了参考依据。
【图文】：

形态图,前体脂肪细胞,黄牛,形态

２．３．１延黄牛前体脂肪细胞形态学观察逡逑本研究采用胶原酶消化法分离细胞，在细胞接种后，多种细胞均匀悬浮在培逡逑养液中（图２．１－Ａ）；用ＰＢＳ冲洗掉未贴壁的杂细胞，前体脂肪细胞轻微贴壁，之逡逑后贴壁的细胞开始逐渐生长（图２．１－Ｂ和图２．１－Ｃ）；随着细胞生长时间的延长，５逡逑ｄ时细胞呈旋涡状，，细胞生长有一定的纹路（图２．１－Ｄ），之后由于空间及营养物逡逑质的限制，呈现生长抑制不再进行增殖，进而退出增殖周期，在转录因子的刺激逡逑下启动随后的脂肪细胞分化程序。逡逑ＨＨＨＨ逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑？．大《＇逦七、逦，逡逑图２．１延黄牛前体脂肪细胞的形态（１０0ｘ）逡逑Ａ：细胞接种２ｈ后形态；Ｂ：接种２ｄ后细胞形态；Ｃ：细胞接种３ｄ后形态；Ｄ：细胞接种５ｄ后形态逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｙａｎ邋Ｙｅｌｌｏｗ邋ｃａｔｔｌｅ邋ｐｒｅ－ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（１０0ｘ）逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｃｅｌ

散点图,油红,脂肪细胞

邋１０００，邋＾ＯＯｐｍｏｌ邋Ｌ／１浓度及其对应的吸光值绘制标准曲线。以各孔的吸光值逡逑为ｙ轴，标准品浓度为ｘ轴绘制散点图，并添加趋势线，显示公式及ｉ？２值，标逡逑准曲线公式如下：Ｙ＝９Ｅ－０５ｘ－０．００６，邋Ｒ２＝０．９９５。结果如图２．４所示，甘油三酯的逡逑含量在前４ｄ时变化缓慢，第４天开始迅速上升。在整个诱导分化的过程中，早逡逑期是形成脂肪细胞的过程，后期脂滴才逐渐积累。逡逑sE逡逑｜邋ｅｏｏ逦／逡逑６００邋／逡逑Ｓ邋ｍ逦／逡逑ｇ邋２００逡逑0＇逦１逦．逦．逦逡逑０逦４逦９逡逑时问（天）逡逑图２．４诱导分化过程中甘油三酯含量的变化逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｔｈｅ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ａｄｉｐｏｇｃｎｅｓｉｓ逡逑３９逡逑
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823.81

【参考文献】