布鲁氏菌VceC缺失菌株的构建及其对山羊滋养层细胞内质网应激的影响

发布时间：2020-04-12 18:52

【摘要】：布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性兼性胞内寄生菌,其所引起的布鲁氏菌病(Brucellosis)在世界范围内流行,给养殖业和公共健康造成严重危害。布鲁氏菌主要感染牛、绵羊和山羊,引起怀孕母畜流产和雄性动物不育。人类感染布鲁氏菌病主要呈现慢性持续性感染,表现波浪热、全身乏力、多汗以及关节疼痛等症状。布鲁氏菌作为胞内寄生性细菌,其独特的胞内生存策略对于布鲁氏菌的致病性具有关键作用。Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion systems,T4SS)是布鲁氏菌的重要毒力因子,在介导布鲁氏菌胞内存活和抑制宿主免疫应答中起关键作用。VceC是布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白,研究其在宿主细胞中的生存及作用机制,对于阐明布鲁氏菌病的发生机制和有效防控具有重要意义。本试验通过构建PUC19G-Vce C同源重组载体并转入猪布鲁氏菌S2株(B.suis S2)感受态细胞中,通过PCR筛选获得VceC缺失菌株(ΔVceC);利用ΔVceC菌株侵染山羊滋养层细胞(goat trophoblast cells,GTC),采用流式细胞术检测GTC凋亡情况,同时用Western Blot检测凋亡通路标志蛋白cleaved caspase3、pro-caspase9以及内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关性促凋亡分子CHOP的表达情况,探究ΔVceC菌株对GTC凋亡的影响;此外,通过检测内质网专有伴侣分子GRP78以及未折叠蛋白质反应(Unfolded protein response,UPR)通路中相关蛋白的表达变化,探究ΔVceC菌株侵染GTC对ERS以及UPR通路的影响,利用Tm和4-PBA改变GTC内质网应激状态,检测ΔVceC菌株侵染GTC对其胞内增殖的影响。试验结果如下:1.克隆布鲁氏菌VceC基因上、下游同源臂以及庆大霉素基因,构建布鲁氏菌同源重组载体PUC19G-VceC,将其转入B.suis S2感受态细胞,通过PCR筛选获得ΔVceC菌株。2.通过流式细胞术检测ΔVceC菌株侵染GTC在12 h、24 h、48 h后的细胞凋亡情况,结果表明ΔVceC菌株促进了GTC凋亡。Western Blot检测凋亡通路蛋白cleaved caspase3、pro-caspase9和CHOP表达量,结果显示cleaved caspase3和CHOP表达量上调,而pro-caspase9的表达量差异不显著,表明ΔVceC菌株可通过内质网应激介导的细胞凋亡通路引起宿主细胞的凋亡。3.用ΔVceC菌株侵染GTC,通过Western Blot检测结果显示在侵染24 h和48 h后,GRP78的表达量显著降低(P0.01),表明ΔVceC菌株侵染GTC可引起其内质网应激。进一步检测激活UPR信号通路的相关蛋白,结果显示,ΔVceC菌株在侵染GTC24 h和48 h后,磷酸化的IRE1表达量相对于B.suis S2是下调的,而eIF2α、ATF6-α和ATF6-β表达量无显著差异,提示VceC参与布鲁氏菌介导的IRE1信号通路的激活。此外,利用Tm和4-PBA改变内质网应激状态,检测ΔVceC菌株侵染GTC对其胞内增殖的影响,结果显示用0.5μg/mL Tm预处理GTC,与B.suis S2组相比,增加GTC内GRP78表达量的同时显著地抑制了ΔVceC菌株在GTC内的增殖;反之,用1μM 4-PBA预处理GTC,与B.suis.S2组相比,ΔVceC菌株组降低了GTC内GRP78的表达量的同时显著增加了ΔVceC菌株在GTC内的增殖,说明不同的内质网应激状态对ΔVceC菌株在GTC内的增殖具有影响。
【图文】：

布鲁氏菌,生存周期,宿主细胞

未折叠蛋白反应是真核细胞中分泌和跨膜蛋白合成，折叠和加工的主要细胞器。炎症和氧化应激在内的病理刺激都会打破内质网的稳态功能，导，这种状况被称为内质网应激。大量研究表明，ERS 在各种心血血性心脏病和动脉粥样硬化的发病机制中起着重要作用。质错误折叠过程中，蛋白质在内质网腔中的积累激活适应性反应蛋白质反应（Unfolded protein response,UPR）（Kadowaki et al. 器检测到 UPR 信号通路包括 IRE1，蛋白激酶样内质网激酶（PRK）和转录激活因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）Schuck et al. 2009）。如果 UPR 不能恢复正常并缓解 ERS，将诱促凋亡分子 C/EP 同源蛋白（C/EP homologous protein，，CHOP）通路，IRE1 肿瘤坏死因子受体相关因子 2 介导的凋亡通路以及图 1-1 布鲁氏菌在宿主细胞内的生存周期（Ke et al. 2015）Fig. 1-1 The life cycle of Brucella within host cells

布鲁氏菌,革兰氏染色

ceC 重组质粒 10 μL 和布鲁氏菌感受态 100 μL 于离杯中，置于电转仪中，电压 1.8 KV，点击时间 6 mB 培养液，置 37℃恒温摇床中 180 rpm/min 24 h。液涂于 TSA 庆大霉素抗性平板上，培养 72 h。筛选中取出 TSA 平板培养基，挑出生长状况良好的单抗性培养基的 10 mL 离心管中，置于 37℃摇床中 h 菌液。采用 PCR 方法鉴定筛选菌株，并将筛选正。染色鉴定结果.suis S2 灭活菌液进行革兰染色，镜检结果如图 2-1性菌，油镜下观察显示为单个散在呈短杆状或球状
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.614

【参考文献】