【摘要】：子宫是奶牛生殖系统重要的组成部分,是胚胎附植及发育的主要场所,其生理结构与功能的完整性直接关系到奶牛的生产繁殖。奶牛产后因子宫颈松弛,子宫内膜上皮受损,易导致子宫感染,造成严重经济损失。引起产后子宫内感染的主要是大肠杆菌,其主要通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)发挥致病作用。甲硫脑啡肽(Met-enkephalin,MENK)是哺乳动物体内天然生成的具有阿片样作用的多肽,MENK及其受体已被证实存在于子宫内膜中。有研究表明,MENK可抑制子宫细胞增殖,但MENK对奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)增殖的作用尚无研究。本试验以BEEC为研究对象,探究在LPS作用下,MENK对细胞增殖活性、细胞周期、细胞增殖相关因子和信号通路的影响。试验一研究MENK对LPS作用下BEEC的增殖影响机制,分为空白组、LPS组(1μg/mL),以及LPS(1 μg/mL)与不同浓度MENK共处理组。试验二进一步利用MENK拮抗剂纳洛酮(Naloxone,NAL),验证MENK对细胞增殖变化的影响,分为空白组、LPS组(1 μg/mL),以及LPS(1 μμg/mL)、不同浓度MENK与NAL共处理组。采用CCK-8法检测细胞活力变化;采用流氏细胞术检测细胞周期变化;采用荧光定量PCR检测细胞增殖相关因子的基因表达;采用Western blot检测细胞增殖相关通路的变化。根据试验一分组处理BEEC 24 h后,LPS处理组细胞增殖活性高于空白组(p0.01);与LPS处理组相比,LPS与MENK(10-6～10-4mol/L)共处理组细胞增殖活性降低(p0.01);MENK单独处理(10-9～10-4mol/L)不影响细胞增殖活性(p0.05)。与空白组相比,LPS处理组G1期细胞数量极显著降低(p0.01),S期细胞数量极显著升高(p0.01),PI极显著升高(p0.01);与LPS处理组相比,LPS和MENK(10-6～10-5mol/L)共处理组G1期细胞数量极显著升高(p0.01),PI极显著降低(p0.01)。与空白组相比,LPS处理组在3 h、6 h和12 h细胞EGFR、VEGF、FGF-2和TGF-β3基因表达量均升高(p0.05);与LPS处理组相比,LPS和MENK(10-6～10-5mol/L)共处理组细胞在6 h和12 h时EGFR、VEGF和FGF-2基因表达量下降(p0.05),TGF-β3基因表达量无显著差异(p0.05)。与空白对照组相比,LPS处理组在30 min时β-catenin、c-Myc、Cyclin D1的蛋白表达,以及PI3K和Akt的磷酸化水平均升高(p0.05);与LPS处理组相比,LPS和MENK(10-7～10-5mol/L)共处理组β-catenin和c-Myc蛋白表达量下降(p0.01),LPS和MENK(10-6～10-5 mol/L)共处理组Cyclin D1蛋白表达量降低(p0.05),细胞PI3K磷酸化水平在LPS与10-6 mol/L～10-5 mol/L MENK共处理下降低(p0.05),Akt磷酸化水平在LPS与 10-5 mol/L MENK共处理下降低(p0.05)。以上结果表明,LPS可促进BEEC细胞的增殖活性和细胞周期进程,上调EGFR、VEGF和FGF-2基因的表达,诱导细胞Wnt/β-catenin和PI3K/Akt通路的激活,MNEK可抑制LPS诱导的BEEC细胞的增殖。根据试验二分组处理BEEC 24 h后,LPS处理组细胞增殖活性极高于空白组(p0.01);与LPS处理组相比,LPS、MENK(10-4mol/L)和NAL(10-4mol/L)共处理组细胞增殖活性降低(p0.01);10-9～10-5mol/LNAL单独处理BEEC不影响细胞增殖活性(p0.05)。与空白组相比,LPS处理组G1期细胞数量极显著降低(p0.01),S期细胞数量极显著升高(p0.01),PI极显著升高(p0.01);与LPS处理组相比,LPS、MENK和NAL共处理组各期细胞数量无显著变化(p0.05),PI无显著差异(p0.05)。与空白组相比,LPS处理组细胞EGFR、VEGF、FGF-2和TGF-β3基因表达量在6h显著升高(p0.05);与LPS处理组相比,LPS、MENK(10-8mol/L～10-5mol/L)和NAL(10-8mol/L～10-5mol/L)共处理组EGFR、VEGF、TGF-β3和FGF-2基因表达量无显著差异(p0.05)。与空白对照组相比,LPS处理组30min时β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表达,以及PI3K和Akt的磷酸化水平量均升高(p0.05);与LPS处理组相比,LPS、MENK(10-8mol/L～10-5mol/L)和NAL(10-8mol/L～10-5mol/L)共处理组β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表达量,以及PI3K和Akt的磷酸化水平无显著差异(p0.05)。这些结果提示MNEK可抑制LPS诱导的细胞增殖活性和Wnt/β-catenin及PI3K/Akt通路的激活,下调EGFR、VEGF和FGF-2基因的表达,且这种抑制作用可被NAL所阻断。综上,MNEK可抑制LPS诱导的细胞增殖和细胞周期进程,下调增殖相关因子EGFR、VEGF和FGF-2的表达,抑制增殖信号通路Wnt/β-catenin和PI3K/Akt的激活,且这种抑制作用可被NAL所阻断,表明MENK可能通过阿片受体介导参与对LPS诱导的BEEC细胞增殖抑制作用。
【图文】：
ｇｒｏｕｐ．逡逑３．２细胞周期变化逡逑如图２－２所示，与空白组相比，ＬＰＳ处理组Ｇ１期细胞数量极显著降低（ｐ＜０．０１），邋Ｓ逡逑期细胞数量极显著升高（Ｐ＜０．０１），邋ＰＩ极显著升高（／？＜0．0１）；与ＬＰＳ处理组相比，ＬＰＳ逡逑（ｌｐｇ／ｍＬ）、ＭＥＮＫ和ＮＡＬ共处理组处于各期细胞数量无显著变化（ｐ＞０．０５）。逡逑
逦Ｔ？ｕ逡逑ＬＰＳ邋（邋“ｌｇ，，ｍＬ邋）邋＋ＭＥｉ５ｉＴ（Ｔ0＊５ｍｏＩ／Ｌ）＋ＮＡＬ（１０＊％ｌｏｌ／Ｌ）逡逑图２－２邋ＮＡＬ对ＢＥＥＣ细胞周期的影响逡逑注：与空白组相比，“＊’＞＜０．０５，邋‘‘＊＊＞＜０．０１；与邋ＬＰＳ邋单独处理组相比，“＃’＞＜０．０５，邋“＃＃’＞＜０．０１逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＮＡＬ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ＢＥＥＣ逡逑Ｎｏｔｅ：逦０５，邋“＊＊’’／？＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；“＃’’／？＜０．０５，逦１，ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＬＰＳ逡逑ｇｒｏｕｐ邋．逡逑３．３细胞增殖相关因子的基因表达变化逡逑ＮＡＬ对ＢＥＥＣ细胞增殖相关因子基因表达的影响如图２－３所示，与空白组相比，ＬＰＳ处逡逑理组ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ－２和ＴＧＦ－ｐ３基因的表达均显著升高（／；＜０．０５）；与ＬＰＳ处理组相逡逑比
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
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