BVDV单克隆抗体的制备及其用于抗病毒药物筛选方法的建立

发布时间：2020-04-15 22:50

【摘要】：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)与猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),绵羊边界病毒(Border disease virus,BDV)等同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,在血清上有交叉反应。该病毒感染能引起牛病毒性—粘膜病(BVD-MD),免疫耐受,孕牛流产或胎儿畸形等。BVDV除了感染牛以外,还可以感染猪、羊、骆驼等40多种动物,并引起发病。持续性感染(Persistant infection,PI)的牛终生带毒、排毒,促进了本病毒的传播。BVDV给养牛业带来了巨大经济损失,根据病毒感染细胞能否产生细胞病变将BVDV分成致细胞病变型BVDV(Cytopathic BVDV,CP-BVDV)和非致细胞病变型BVDV(NoncytopathicBVDV,NCP-BVDV),PI牛主要是由于NCP-BVDV感染所致。BVDV防控依赖于有效的快速诊断方法进行监测,安全高效的疫苗进行预防和有效的抗病毒药物进行治疗。目前我国仍然缺乏自主研发的BVDV快速检测技术,NCP-BVDV不能产生细胞病变,不能采用常规的方法测定病毒滴度,这极大限制了抗病毒药物的筛选。本研究的终极目标是建立BVDV抗原和/或抗体检测试纸,并建立针对NCP-BVDV的滴度测定方法而建立抗病毒药物筛选方法。本研究首先利用切向流过滤和琼脂糖凝胶分子筛Sepherose 4 Fast Flow对病毒NCP-BVDV进行纯化,通过免疫BALB/C小鼠制备了针对抗BVDV的单克隆抗体。获得5株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为9G6D6、14G5F2、19A3H8、28H11G4、31D11C11。免疫染色方法测得腹水抗体的效价分别为1.28X 105、1.28X 105、1.02×106、1.28X 105、3.2×103。5株单克隆抗体的轻链亚型均为Kappa,重链均为lgGl。5株单抗均不与CSFV产生交叉反应。19A3H8具有中和反应活性,中和效价为1:6400。试图用5株单抗进行抗原试纸条的制备,但效果均不理想。为了建立高效简单的用于NCP-BVDV抗病毒药物的筛选方法,本研究利用上述单抗,建立了免疫染色的方法。通过利用免疫染色方法和荧光定量PCR对两种已知抗BVDV药物Ribavirin、Ammonium Chloride进行试验,证明了免疫染色方法的有效性,另外利用该方法研究发现PLC抑制剂U73122也影响NCP-BVDV复制。为了制备具有生物学活性的BVDVEms蛋白,我们采用两种策略:将N端部分氨基酸进行原核表达和对BVDV Ems全长进行真核表达。将BVDV N-末端Ems基因克隆到原核表达载体pET-28a上,构建pETT-28a-N-Erns重组质粒,在BL21(DE3)pLysS细菌中,经IPTG诱导表达,蛋白以包涵体形式存在,经变复性后,作为抗原包板,ELISA检测,与BVDV阳性血清有较好的反应,说明原核表达的BVDVN-末端Erns有较好的生物学活性(反应原性)。将BVDV Erns E2基因克隆连接到真核载体pEGFP-Nl,构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-Ems和pEGFP-Nl-E2转染入293T细胞中,发现只有Erns能够成功表达。综上所述,本研究制备了针对BVDV的单克隆抗体,并建立了一种简单可靠的方法用于测定NCP-BVDV滴度及用于抗病毒药物筛选,易于在生产和科研中推广和应用。并且成功的原核表达出了 BVDVN-末端Erns蛋白,以及真核表达出了 BVDVEms蛋白。原核表达的抗原Erns片段具有生物学活性,对后续ELISA抗体检测试剂盒的研究奠定基础,Ems真核表达的成功为后续针对Erns的单克隆抗体的制备奠定基础。
【图文】：

３．２．１对ＢＶＤＶ纯化前后进行病毒滴度的测定逡逑将纯化前ＢＶＤＶ上清、纯化后收集的第一个峰物质以及纯化后收集的第二个峰物质进逡逑行ＴＣＩＤ５（）的测定，由图１－２可知，纯化后的病毒是在第一个峰收集的，，且病毒滴度升高了。逡逑

ｌ：Ｖｉｒｕｓ邋ｓｔｏｃｋｓ；邋２：Ｐｅａｋ邋１邋ｂｙ邋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ邋４ＦＦ；邋３：Ｐｅａｋ邋２邋ｂｙ邋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ邋４ＦＦ逡逑３．２．２免疫染色测定ＢＶＤＶ活性逡逑免疫染色对纯化前后的ＢＶＤＶ进行了活性鉴定，从图１－３可知，纯化后的ＢＶＤＶ依逡逑旧具有很好感染ＭＤＢ１Ｃ细胞的能力。逡逑■■■■■■■■■■■■■Ｉ逡逑Ａ逦ｎ逦Ｂ逡逑一邋，逡逑图１－３切向流膜包与琼脂糖凝胶分子筛纯化后的病毒活性鉴定逡逑Ａ：纯化后ＢＶＤＶ感染ＭＤＢＫ；邋Ｂ：未感染ＢＶＤＶ的ＭＤＢＫ细胞逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＴＦＦ－ＳＥＣ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｖｉｒｕｓ逡逑Ａ：邋ＭＤＢＫ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＴＦＦ－ＳＥＣ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＢＶＤＶ；逡逑Ｂ：邋ＭＤＢＫ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｍｏｃｋ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

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