黄芪注射液对大鼠不同时期肝癌的作用及机制研究

发布时间：2020-04-17 20:45

【摘要】：随着我国宠物行业的快速发展,肿瘤性疾病成为威胁宠物生命的主要原因之一,肿瘤作为犬猫的常见病与多发病,其发病几率呈逐年上升的趋势。人和动物在日常生活中接触的致癌剂中有60%会导致肝癌。大多数致癌物质通过诱导DNA损伤,促进肿瘤细胞的增殖发挥致癌作用,因此抑制癌细胞增殖是治疗癌症的重点。黄芪作为中药中补益药的代表,在中国已经有上千年的药用历史。现代药理学表明,黄芪含皂苷类、黄酮、多糖、氨基酸和多种微量元素,具有保肝、抗肿瘤、清除自由基(抗氧化)、修复DNA损伤的作用。黄芪注射液(Astragalus injection,AI)是由黄芪提取物为主要成分的药物,临床上广泛用于心气虚损、血脉淤阻之病如心肌炎,心功能不全脾虚湿因之肝炎等疾病。近几年来,许多研究结果表明黄芪的有效成分对多种类型的癌细胞系具有抑制增殖,促进凋亡,阻滞细胞周期的作用,但黄芪注射液对体内肝癌是否有同样的作用尚未确认,特别是对体内肝癌细胞增殖活性的作用机制尚未系统的研究过。本试验中,使用遗传毒性致癌物N-二乙基亚硝胺(N-diethylnitrosamine,DEN)作为启动剂,胡椒基丁醚(Piperonyl butoxite,PBO)和N-亚硝基吗啉(Nnitrosomorpholine,NMOR)分别作为早期肝癌和中晚期肝癌建模中的促进剂,建立了不同时期的肝癌模型,并进行了黄芪注射液的抗癌药效试验。首先确认了黄芪注射液对不同时期肝癌的抑制作用。其次,从细胞周期和细胞凋亡相关信号通路两方面入手,在mRNA和蛋白水平上检测黄芪注射液对肝癌细胞增殖活性的影响,并分析了它的抗癌分子机制。具体实验结果如下:1.利用短期致癌模型的黄芪注射液对早期肝癌不同阶段的影响及机制研究使用DEN和PBO建立两阶段早期肝癌模型。大鼠共分为四组:1组,DEN单独组;2组,DEN+PBO组;3组,DEN+PBO+AI-EPI(early postinitiation,启动阶段)组;4组,DEN+PBO+AI-LPI(late postinitiation,促进阶段)组。实验开始时,所有大鼠腹腔注射200 mg/kg DEN一次,第3周开始,除DEN单独组外其余三组开始饲喂含0.5%的PBO粉末饲料,共8周。后两组分别在启动阶段的2周和促进阶段的8周腹腔注射5 mL/kg/day的黄芪注射液。结果,与DEN单独组相比,DEN+PBO组中大鼠肝癌癌前病灶生物标记物胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase placental form,GST-P)阳性灶的数量和面积明显增加。与DEN+PBO组相比,DEN+PBO+AI-EPI组的GST-P阳性灶的数量和面积没有明显变化,但是在DEN+PBO+AI-LPI组有明显的减少趋势。在细胞增殖活性生物标记物Ki67免疫染色中,DEN+PBO组的Ki67阳性细胞率显著高于DEN单独组,但是与DEN+PBO组相比,给予AI的两组的Ki67阳性细胞率显著减少。基因表达分析结果显示,与DEN+PBO组相比,AI的促进阶段处理可显著增加Ccne1,Cdkn1b,Rb1,Bax,Bcl-2,Casp3和Casp9的表达量;然而,启动阶段的AI处理没有改变这些基因的表达量。这些结果表明,促进阶段的AI处理在低剂量PBO促进的早期肝癌有微弱的抑制作用,其机制主要是通过诱导抑制细胞周期基因及凋亡相关基因的高表达,引起细胞周期G1/S期阻滞和凋亡。此外,启动阶段的AI处理对低剂量PBO促进的肝癌没有影响。2.利用两阶段致癌模型的黄芪注射液对中晚期肝癌的治疗效果及机制研究使用DEN和NMOR建立了大鼠中晚期肝癌模型,并将建模后的动物分为DEN+NMOR组(模型组)和DEN+NMOR+AI组(给药组)。另外,还设立了没有处理的对照组。实验开始时,模型组和给药组的大鼠腹腔注射200 mg/kg DEN后灌胃80 ppm NMOR 17周。18周开始为给药组大鼠腹腔注射5 mL/kg/day黄芪注射液6周,模型组不进行任何处理。实验结束后处死所有生存动物,并大体解剖,对肝、肺、脾,肾、心进行称重。实验结果显示,模型组与给药组在实验结束后的生存率分别为55%和73%。模型组及给药组的体重均极显著的低于对照组,且给药组体重显著低于模型组。与对照组相比,模型组和给药组的相对肺重量均显著增加,绝对肾重量和绝对心重量显著减少。与模型组相比,给药组的相对肺重量显著增加,肾和心的绝对重量显著减少。病理学检查结果表明,模型组和给药组的肝癌发生率都是91%,肝腺瘤发生率分别为63%和54%,无统计学差异。肝癌转移灶主要在肺,两组的转移率无显著差异。另外,两组大鼠的病理组织学检查还发现肝脏胆管增生,肺腺瘤,脾髓外造血亢进等病理变化。免疫组织学检查结果显示,给药组的Ki67阳性细胞率与模型组相比显著降低,且有统计学差异。GST-P阳性病灶的数量和面积以及凋亡染色的阳性细胞率在模型组和给药组之间没有显著差异。基因表达分析结果显示,在早期实验中显著增加的Casp3,Rb1,p21和Cdkn1b的mRNA表达量与模型组相比在给药组仍保持高水平。这些结果表明,黄芪注射液通过诱导细胞周期阻滞和促进凋亡信号通路的激活,在一定时间内可以延长大鼠的生存时间,但是不能抑制肝癌的转移。综上所述,黄芪注射液虽然不能有效抑制大鼠肝癌的转移,但是对不同时期的肝癌均具有一定程度的抑制细胞增殖活性作用,且这种抑制作用有助于黄芪注射液的抗癌,特别是在早期肝癌的促进阶段更为明显。具体机制为,黄芪注射液通过G1/S期阻滞和caspase-9/3途径激活抑制细胞增殖活性并诱导细胞凋亡,从而抑制肝癌的发展。本实验为了模拟临床,用致癌物诱导肝癌建立动物模型进行了抗癌实验,并确认了黄芪注射液的抗癌作用。这些结果不仅为动物及人类的癌症治疗提供了重要的科学依据,并且为天然抗癌药的抗癌机制的研究与发展提供了重要的理论依据。
【图文】：

实验设计,肝脏

图 3.1 实验设计图Figure 3.1 Experimental design2.1.2 大鼠 2/3 肝脏切除手术首先使用乙醚对大鼠进行深度吸入麻醉。其次，手术部位进行消毒后剪开皮肤和腹部肌层挤出肝脏，用结扎线结扎好肝脏的中间叶和外侧左叶，并剪去该叶，确认切除部不出血后进行缝合，最后用碘伏消毒手术部位。实验结束后，积极关注大鼠状态。2.2 肝脏样品的采集及处理动物实验结束后，对大鼠进行乙醚麻醉，腹主动脉放血处死，取下肝脏。肉眼观察大鼠肝脏，记录病变。称量肝重，计算每只动物的肝脏的脏体系数：肝脏脏体系数（g/100g）= 肝脏绝对重量 /（大鼠剖前体重×100）对取出的肝脏后，分离外侧右叶和右叶尾部，各取材 2 段，每段 0.5 cm 左右厚度，分两份置于标记好的包埋盒中，标本置于 10% 福尔马林缓冲液中固定保存，

增长曲线,大鼠,体重,肝切除术

P <0.01 为差异极显著。“*”或“**”表示与 DEN 单独组相比性，“#”或“# #”表示与模型组相比的显著性。果床状态，体重及肝重整个实验过程中，所有大鼠未发现异常，仅三只大鼠由于肝切除术死亡。饲O 粉末饲料的大鼠从第 2 周到实验结束，体重增加受到抑制（图 3.2）。PBO+AI-LPI组的最终体重与 DEN+PBO 组相比明显下降，但 DEN+PBO+AI-未见明显变化。在肝重量中，与 DEN 单独组相比，饲喂 PBO 的三组大鼠的重量均极显著增加（表 3.1）。但 DEN+PBO+AI-LPI 组的绝对和相对肝重量 DEN+PBO 组，且其绝对肝重量与 DEN+PBO 组相比有显著差异。相反，，PBO+AI-EPI 组的绝对和相对肝重均相比 DEN+PBO 组有所上升，但无统计。实验全程各组的摄食量之间没有显著差异（图 3.3）。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S853.7

【参考文献】