miR-331-3p对猪前体脂肪细胞增殖、分化与脂肪酸积累的调控

发布时间：2020-04-18 13:11

【摘要】：miRNAs是在真核生物中被发现的一类内源性的单链非编码小RNA,其长度18-25nt左右,miRNA在不同物种间具有严格的保守性,具有调控基因转录后翻译的作用,能够参与多种生命活动,包括有机体的发育过程,机体的免疫过程,甚至能够参与到肿瘤癌症的发生和成熟脂肪细胞的形成等过程。成熟脂肪细胞的形成是一个极其复杂的生物过程,涉及到诸多因素的调控作用。成熟脂肪细胞的形成过程主要包括三个主要的阶段,包括间充质干细胞形成前体脂肪细胞,前体脂肪细胞生长增殖以及前体脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞,这其中后两个阶段是成熟脂肪细胞形成的重要部分。本研究通过转录组测序的结果以及阅读相关的文献,选取了差异表达的miR-331-3p进行更深入研究。并通过相关实验证明了miR-331-3p参与到猪的前体脂肪细胞增殖、分化与脂肪酸代谢过程中。主要研究结果如下:1、过表达miR-331-3p后,通过CCK8试剂分析细胞生长状况检测,发现细胞生长速度减慢,并且流式细胞术分析的结果处于G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降也与CCK8实验结果相符合。过表达miR-331-3p后,利用qRT-PCR检测了细胞周期相关基因,发现促进细胞增殖相关的基因mRNA水平均显著降低,而抑制细胞增殖的相关基因的mRNA水平显著升高。结果表明miR-331-3p具有抑制猪前体脂肪细胞增殖的调控作用。2、过表达miR-331-3p后,将前体脂肪细胞诱导分化并通过qRT-PCR的方法检测miR-331-3p在前体脂肪细胞分化过程中的表达趋势以及检测其分化过程中前体脂肪细胞分化标志基因PPARγ的表达变化,发现miR-331-3p具有促进前体脂肪细胞分化的作用。3、利用生物信息学的方法预测到了和脂肪酸代谢相关的基因DLST和SLC25A1基因,通过双荧光素酶报告系统荧光素酶表达量的变化验证了DLST为miR-331-3p的靶基因,并且过表达miR-331-3p能够显著降低DLST mRNA水平和蛋白水平的表达。DLST基因编码的酶存在于柠檬酸丙酮酸循环通路中,这条通路能够将细胞合成脂肪酸的所必需的乙酰-COA从线粒体中转运到细胞质中。根据DLST、SLC25A1基因以及其通路上下游基因特别是其中ACLY和FAS基因的荧光定量结果,过表达miR-331-3p后脂肪酸合成增加。油红O染色以及脂滴的定量均表明过表达miR-331-3p后脂肪酸合成增加,转染inhibitor效果均相反,也证明了miR-331-3p可以通过柠檬酸丙酮酸循环通路促进脂肪酸的合成。综上所述,本研究系统的分析了miR-331-3p对于前体脂肪细胞增殖分化与脂肪酸累积的调控,最终证明了miR-331-3p能够抑制前体脂肪细胞增殖,促进其分化成为成熟脂肪细胞以及能够促进脂肪酸积累。
【图文】：

组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图

背膘,背最长肌,靶基因

1-3p 对猪前体脂肪细胞增殖、分化与脂肪酸积累的调控28图3-2 背最长肌和背膘中miR-331-3p的qPCR结果.Figure 3-2 qPCR result of the expression level of miR-331-3p in muscle and backfat.3.2 miR-331-3p 调控的靶基因验证3.2.1 miR-331-3p 的靶基因预测采用靶基因在线预测软件 Targetscan：（http ://www.targetscan.org/.）、miRanda：（ http://www.microrna.org/microrna/home.do ）和 miRWalk (http://zmf.umm.uni -heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/) 预测 miR-331-3p 的靶基因为二氢硫辛酰胺 S-琥珀酰转移酶 (dihydrolipoamideS-succinyltransferase，DLST) 和溶质载体家族 25 成员 1(solutecarrier family 25 member 1，SLC25A1)。发现 DLST 和 SLC25A1 基因的 3’UTR 区域均存在这 miR-331-3p 种子序列的互补区域，，并且该区域在物种之间保守 (见图 3-3)。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828

【参考文献】