维生素K对肉鸡骨骼质量的调控作用

发布时间：2020-04-19 19:18

【摘要】：本试验通过体外细胞培养和肉鸡养殖试验探讨了维生素K对肉鸡骨骼质量的调控作用。1.鸡胚成骨细胞的分离培养及鉴定通过大量试验摸索,利用酶消化法改进了鸡胚成骨细胞分离培养的方法,通过一系列的鉴定,表明本试验所分离的成骨细胞具有较高碱性磷酸酶活性、能够分泌I型胶原酶、形成钙化结节的特性。2.VK_2对鸡胚成骨细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性的影响用不同水平的VK_2(0μM、10~(-1)μM、10~(-2)μM、10~(-3)μM、10~(-4)μM、10~(-5)μM)处理鸡胚成骨细胞,用CCK8法测定各组细胞在450 nm处的吸光度来描述鸡胚成骨细胞的增殖能力,并检测其碱性磷酸酶活性。结果显示:成骨细胞的活力随VK_2浓度的增加先增加再降低,培养基中添加浓度为10~(-4)μM、10~(-3)μM、10~(-2)μM的VK_2可以显著增加成骨细胞的活力(P0.05)。同时,成骨细胞碱性磷酸酶活性随VK_2浓度的增加先增加再降低,培养基中添加浓度为10~(-4)μM、10~(-3)μM的VK_2可以显著增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性(P0.05)。3.VK_2对地塞米松引起鸡胚成骨细胞损伤的缓解作用(1)研究不同浓度的地塞米松对成骨细胞活性的影响:用不同水平的地塞米松(100μM、80μM、60μM、40μM、20μM、0μM)处理细胞,用CCK8法测定细胞增殖能力。结果显示:地塞米松能降低成骨细胞的活力,且与浓度有关。成骨细胞的活力最低的地塞米松最低浓度为60μM(P0.05)。(2)研究VK_2对地塞米松引起鸡胚成骨细胞损伤的缓解作用:用不同浓度的VK_2和地塞米松(0μM地塞米松+0μM VK_2、60μM地塞米松+0μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-5)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-4)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-3)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-2)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-1)μM VK_2)处理细胞,CCK8法测细胞增殖能力。结果显示:用60μM的地塞米松与不同浓度的VK_2同时作用于成骨细胞,成骨细胞的活力随着VK_2浓度的增加先增加再降低,当VK_2浓度为10~(-4)μM时,成骨细胞活力最高(P0.05)。4.体内试验试验选用360只1日龄爱拔益加(AA~+)公鸡(平均体重45±0.5g),按每个处理组平均体重基本一致原则随机分成3个处理组:对照组、0.5 mg/kg VK_3组、4 mg/kg VK_3组。每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础日粮,其余两组分别饲喂添加0.5 mg/kg(NRC推荐水平)和4 mg/kg VK_3的基础日粮,基础日粮中不额外添加维生素K;所有肉鸡用不额外添加维生素K的日粮预饲3天后开始正式试验,正式试验周期为42天。在正式试验的第21天和42天,每重复随机选取3只体重相近的肉鸡,翅下静脉采血,屠宰取样。结果显示:4.1肉鸡生长性能、腿病和血液生化指标与不添加维生素K_3组相比,日粮中添加0.5 mg/kg和4 mg/kg维生素K_3显著增加了肉鸡平均日增重(21-42 d和1-42 d)(P0.05),降低料重比(1-21d、21-42 d和1-42 d)(P0.05),但对平均日采食量无影响;提高了21日龄肉鸡血清钙含量(P0.05);与不添加维生素K相比,日粮中添加0.5 mg/kg显著提高了42日龄肉鸡血清钙含量(P0.05);日粮中添加4 mg/kg维生素K_3显著降低了21日龄肉鸡血清CREA水平(P0.05)。在d 42,与日粮中添加维生素K_3相比,不添加维生素K_3导致腿病发生率显著增加(P0.05)。4.2肉鸡血清钙磷标志物、血浆激素水平结果显示:与日粮中不添加维生素K_3组相比,日粮中添加0.5 mg/kg维生素K_3提高了21日龄肉鸡血清OCN水平(P0.05),降低21日龄肉鸡血清BALP水平(P0.05),日粮中添加4 mg/kg维生素K_3降低21日龄肉鸡血清BALP水平(P0.05)。与日粮中不添加维生素K_3组相比,日粮中添加0.5 mg/kg维生素K_3组提高肉鸡42日龄血清OCN水平(P0.05),显著降低肉鸡血清BALP水平(P0.05)。与日粮中不添加维生素K_3组相比,日粮中添加4 mg/kg维生素K_3显著提高42日龄肉鸡血清OCN水平(P0.05),降低42日龄肉鸡血清BALP水平(P0.05)。与日粮中不添加维生素K_3组相比,日粮添加0.5 mg/kg维生素K_3降低21日龄肉鸡血浆PTH水平(P0.05),日粮中添加4 mg/kg维生素K_3降低21日龄肉鸡PTH水平(P0.05)且提高了肉鸡血浆CT水平(P0.05)。4.3肉鸡骨骼质量指标及胫骨化学组成与不添加维生素K_3组相比,日粮中添加4 mg/kg K_3提高了21日龄肉鸡胫骨中钙的含量和钙磷比(P0.05);日粮中添加0.5 mg/kg VK_3增加了21日龄肉鸡胫骨中的灰分含量(P0.05);日粮中添加4 mg/kg VK_3显著降低了42日龄肉鸡胫骨磷的含量和增加了钙磷比(P0.05);日粮中添加0.5 mg/kg和4 mg/kg VK_3都显著增加了42日龄肉鸡胫骨灰分的含量(P0.05)。与日粮中不添加维生素K_3组相比,日粮中添加4 mg/kg VK_3增加了21日龄肉鸡的胫骨强度(P0.05);日粮中添加0.5 mg/kg VK_3和4 mg/kg VK_3组增加了42日龄肉鸡的胫骨强度(P0.05)。4.4肉鸡胫骨成骨标志基因mRNA水平与不添加维生素K_3组相比,日粮中添加0.5 mg/kg的维生素K_3显著提高了21日龄OCN、RUNX2 mRNA水平(P0.05),对ALPL mRNA水平无影响(P0.05)。与不添加维生素K_3组相比,日粮中添加4 mg/kg的维生素K_3提高了21日龄ALPL、OCN、RUNX2 mRNA水平(P0.05);日粮中添加0.5mg/kg或4 mg/kg的维生素K_3提高了42日龄ALPL、RUNX2 mRNA水平(P0.05),对OCN mRNA水平无影响(P0.05)。结论:维生素K_3可促进鸡胚成骨细胞的生长及提高碱性磷酸酶的活性,并对地塞米松导致的成骨细胞生长抑制有缓解作用。日粮中不添加维生素K可增加腿病风险,添加维生素K可以改善肉鸡骨骼健康状况,这可能与维生素K_3的添加提高了ALPL、OCN、RUNX2基因的mRNA水平有关。
【图文】：

胞形态观察后，培养 24 h，倒置显微镜观察，，分后可见细胞增殖及大量细胞从组织块形或多边形的。6 天后细胞快速增殖殖最为显著呈铺路石状，原因可能是8 天后细胞达到 90%融合消化传代。代细胞倒置显微镜观察（如图 1.1），贴体感强，体积较原代细胞大，分布较形、纺锤形等。细胞核呈圆形或卵圆形被染成紫红，细胞质被染成紫兰色。

图 1.2 第 2 代成骨细胞（碱性磷酸酶染色，10×20）.2.3 鸡胚成骨细胞 I 型胶原染色鉴定鸡胚成骨细胞 I 型胶原染色鉴定结果如图 1.3。荧光显微镜下可见，I 型胶原阳性成骨细胞（a、b、c）细胞质呈绿色，核呈蓝色，阳性细胞比例达 95%以上，阴性成骨细胞（d、e、f）不显色
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831.5

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本文编号：2633647