共表达基因Ⅶ型新城疫F蛋白及鸡IL18沙门菌的构建及免疫效力评价

发布时间：2020-04-20 01:01

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是严重危害禽业的传染病之一,世界动物卫生组织(OIE)将此列为必报传染病。预防ND的主要手段以接种疫苗为主,目前市场上主要的疫苗对基因Ⅶ型ND保护效果欠佳,因此研究针对基因Ⅶ型ND疫苗具有重要意义。DNA疫苗作为继第一代疫苗(微生物疫苗)和第二代疫苗(亚单位疫苗)后的第三代疫苗,能诱导体液免疫和细胞免疫。为了研究针对基因Ⅶ型ND的DNA疫苗,本研究将真核表达密码子优化的F基因连接到真核表达载体pYA4545上,构建了CMV启动子控制的真核表达质粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,命名为pYA4545-F。为了增强免疫效果,将含有原核启动子Ptrc的鸡白介素18(chicken interferon 18,cIL-18)基因片段连接到pYA4545-F上,构建双启动子共表达的pYA4545-pUC-F-opt-Ptrc-cIL18-TT-Flag质粒,命名为pYA4545-F-IL18。分别将pYA4545-F及pYA4545-F-IL18质粒电转到延迟裂解型沙门菌载体χ11218中,口服免疫雏鸡后评价其免疫效应。具体研究内容及结果如下:(1)重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)制备及反应原性分析首先,以优化过密码子的F基因pUC-F-opt为模板,构建出携带Flag标签的pUC-F-opt-Flag,将其与真核表达载体pYA4545连接构建pYA4545-F真核表达质粒。其次,以本实验室构建的质粒pYA3342-cIL-18为模板设计引物,扩增包括原核启动子Ptrc、cIL-18片段及终止子TT的片段Ptrc-cIL18-TT,将其与之前构建好的pYA4545-pUC-F-opt-Flag质粒连接,构建含有双表达启动子(CMV真核启动子及Ptrc原核启动子)的pYA4545-F-IL18质粒,进而通过WesternBlot和间接免疫荧光的方法确认F蛋白和cIL18蛋白成功表达,且具有良好的免疫原性。将质粒pYA4545-F和pYA4545-F-IL18电转进入延迟裂解型沙门菌载体中获得重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)(2)重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)免疫保护效果比较与评价通过免疫保护试验对重组沙门菌的免疫保护效果进行评价。将100只1日龄雏鸡分为5组,每组20只,于第7日、第21日口服接种免疫实验组χ11218(pYA4545)组、χ11218(pYA4545-F)组和χ11218(pYA4545-F-IL18)组),生理盐水对照组口服等量生理盐水,NDV灭活疫苗组仅在第14天颈部皮下注射免疫。35日龄时,对各组雏鸡进行实验分析,通过流式细胞术检测脾脏和外周血中T淋巴细胞和B淋巴细胞数量的变化,结果显示重组菌能使T、B淋巴细胞增多,产生良好的免疫应答。MTT法检测免疫后雏鸡法氏囊B淋巴细胞增殖能力,结果表明χ11218(pYA4545-F)组和χ11218(pYA4545-F-IL18)组的B淋巴细胞对PMA的刺激有明显的反应性,证明重组菌能提高鸡法氏囊B淋巴细胞的增殖能力。ELISA方法检测血清中NDV抗体含量、IL-4含量、IL-18含量和肠道灌洗液中IgA含量,结果表明重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能提高血清中NDV抗体、IL-4、IL-18以及肠道灌洗液中IgA含量。同时免疫保护试验结果显示:重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能对基因Ⅶ型ND具有一定免疫保护效果。病理切片结果显示χ11218(pYA4545-F)组、χ11218(pYA4545-F-IL18)组虽没有灭活疫苗组保护效果好但与生理盐水组和χ11218(pYA4545)组相比胸腺组织和肺组织病理变化较轻。以上结果说明了重组沙门菌具有较好的保护作用,为以延迟裂解性沙门菌作为ND疫苗活载体提供了理论依据,为新城疫DNA疫苗的提供了新思路。
【图文】：

质粒图谱,质粒,标签

图 1.1: 质粒 pYA4545-F 和 pYA4545-F-IL18 的质粒图谱Fig.1.1: Plasmid maps of pYA4545-F and pYA4545-F-IL181.2.2 携带 Flag 标签的 pUC-F-opt 基因的扩增

质量标准,基因

1.1 pUC-F-opt 基因片段扩增结果子质量标准；1 ：pUC-F-opt 基因片.1 Amplification of pUC-F-opt genes Marker ； 1： Product for pUC-F-o
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

【参考文献】