沙门氏菌中sRNA伴侣蛋白Hfq靶基因的寻找

发布时间：2020-04-22 16:43

【摘要】：沙门氏菌(Salmonella)为肠杆菌科、沙门氏菌属成员,是一类革兰氏阴性肠杆菌,该菌对我国畜禽养殖业威胁较大,同时也可以引起食源性污染从而严重威胁人类健康和食品安全。细菌s RNA是近些年来发现的一类细菌重要生命活动调控因子,其中反式s RNA需要细菌s RNA伴侣蛋白Hfq协同调控毒力基因表达、压力应答、营养物质吸收、适应环境变化及群体感应中发挥重要作用。本研究以鼠伤寒沙门氏菌标准株为模版,构建出鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株,将鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株分别培养至对数期和稳定期,提取RNA进行转录组测序,筛选差异表达基因、进行GO富集分析和Pathway富集分析,并筛选部分差异表达基因进行荧光定量PCR验证,筛选相关通路进行深入分析,筛选沙门氏菌hfq基因缺失株重要调控基因。1.鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的构建及鉴定采用P22噬菌体转导技术,以鼠伤寒沙门氏菌yifk::Mud K△hfq::cat基因缺失株为供体菌,鼠伤寒沙门氏菌标准株为受体菌,构建鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株,PCR扩增及基因测序结果表明鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株构建成功。2.鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的转录组分析对鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的转录组测序结果采用DEseq2的算法,在对数期筛选出差异表达基因1055个,其中表达显著上调基因516个,表达显著下调基因539个,在稳定期筛选出差异表达基因959个,其中表达显著上调基因496个,表达显著下调基因463个。对随机筛选的STM3630,STM2890,STM2874,STM3764,STM4361,STM2898,STM2640,STM2893,STM1583,STM2897和STM1091等11个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,趋势与转录组测序相符,表明转录组测序结果可靠。将鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的差异表达基因在GO数据库和KEGG数据库中注释,对数期显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、碳水化合物代谢过程等生物过程中,以及细菌趋化性、丙酸代谢、碳代谢、ABC转运蛋白、不同环境中的微生物代谢、卟啉与叶绿素代谢、光合生物固碳、戊糖磷酸途径、原核生物中的固碳途径、柠檬酸循环和糖酵解途径等11个信号通路中。稳定期显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、胞质过程、核糖体RNA结合过程等生物学过程,卟啉和叶绿素代谢等信号通路中。3.基于转录组结果分析的鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株重要差异共表达基因筛选在鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序的基础上,筛选致病机制生物学过程,趋化性通路、分泌通路、ABC转运蛋白通路、双组分通路和群体感应通路等信号通路的富集基因。在对数期对致病机制生物学过程,趋化性通路、分泌通路、ABC转运蛋白通路、双组分通路和群体感应通路等信号通路进行筛选差异表达基因筛选,分别筛选出27、12、11、66、68和18个基因。在稳定期对致病机制生物学过程,趋化性、分泌、ABC转运蛋白、双组分系统和群体感应等信号通路进行筛选差异表达基因筛选,分别筛选出36、6、15、49、56和18个基因。筛选对数期和稳定期生物学过程及信号通路差异共表达基因,在致病机制生物学过程及趋化性通路、分泌通路、ABC转运蛋白通路、双组分通路和群体感应等信号通路中分别筛选到14、4、7、20、16和5个基因,在以上生物学过程及信号通路中参与两个及以上的重要差异共表达基因有8个,分别为hilA、spaS、invG、spaP、invA、pstS、STM1678、mppA,提示可能为鼠伤寒沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq的调控靶基因。综上所述,采用P22噬菌体转导技术成功构建鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株,将鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株分别培养至对数期和稳定期进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO富集分析和Pathway富集分析,筛选对数期和稳定期相关功能生物学过程和信号通路差异共表达基因,寻找到hfq可能靶基因8个。
【图文】：

细菌,大肠杆菌,沙门氏菌,金黄色

2016；Vogel et al.，，2009）。细菌中约 98%调控因子，它可以激活或者抑制靶点，正向或点，大量细菌 sRNA 及其伴侣蛋白 Hfq 的调善。现，大肠杆菌 6S RNA 被发现为细菌中首个非AMicF 抑制 OmpF mRNA 的转录（Mizuno 随着科学技术的发展和进步，一些新的检测技域，随后在大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡了 sRNA，并且大肠杆菌 sRNA 因为与其他细知，截至目前在 sRNAMap 数据库中发现的过 80 种，沙门氏菌 sRNA 超过 30 种。

小RNA,顺式,调节作用,核糖体结合位点

图 2 顺式编码的小 RNA 的调节作用Fig. 2 Regulation of cis-encoded small RNA码的 sRNA 是细菌 sRNA 发挥调节功能最为普遍的一种形式，目前大多数都属于这个类型。它通常作用于远处的一或多个靶点，同靶么抑制或促进靶 mRNA 的转译，要么加速或减缓靶 mRNA 的降解（RprA 等 sRNA 通过与 mRNA 本是发夹结构的 5’非翻译区结合，’非翻译区结合的核糖体结合位点，从而使之与核糖体结合，促进等 sRNA 则是发挥抑制作用，与靠近靶标 mRNA 核糖体结合位点基配对，导致核糖体无法与之结合、抑制翻译起始，另外细菌核糖作用 sRNA-Hfq-mRNA 复合体从而降解靶 mRNA 和 sRNA。它们伴侣 Hfq 结合发挥作用（Hoe et al.，2013）。所示，顺式编码 sRNA 和反式编码 sRNA 的区别在于顺式编码的 sR因重叠，它们有一个完美的配对区，而反式编码的 sRNA 基因通常
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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