十二指肠贾第虫sgRNA启动子的筛选及其转染系统的构建

发布时间：2020-04-23 00:22

【摘要】：十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)简称贾第虫,是一种重要的人兽共患原虫,由贾第虫寄生在宿主小肠中,感染并引起的贾第虫病(giardiasis)呈世界性分布,其引起感染者的主要症状是腹泻。贾第虫的宿主广泛,包括多种脊椎动物。贾第虫属于单细胞真核生物,其结构简单,基因含量少且紧凑,编码区极短。贾第虫生活史非常简单,仅有感染期可长期抵抗外界不良环境而存在的包囊和成熟期可复制繁衍导致疾病产生的滋养体两个阶段。人类由于食用或饮用了被包囊污染的食物和水而引起贾第虫感染,贾第虫常导致宿主腹泻、恶心、呕吐和体重减轻,还可引起肠易激综合征(IBS)、食物过敏、关节炎或慢性疲劳综合症等多种并发症。营养状况、免疫状态、混合感染和肠道正常菌群的差异都会影响贾第虫的感染能力。贾第虫属于真核生物的分支,位于真核生物进化的底端,是研究高等真核生物进化的重要生物模型。近年来,可编辑核酸酶的引入极大提高了基因组编辑的效率。目前研究人员使用最广泛的是CRISPR工具,应用该工具切断基因组双链DNA,从而产生基因组的变异。CRISPR/Cas9属于II型CRISPR系统,最初是在细菌和古细菌中发现的,有两种关键性构建核心:Cas9蛋白和sgRNA,sgRNA由tracrRNA和crRNA结合的复合物组成,在细胞内被内切酶III水解间隔区和部分重复序列形成成熟的sgRNA。在最后一步干扰中,sgRNA将Cas9蛋白引导到一个与sgRNA互补的靶序列然后将其降解。在构建细胞的CRISPR/Cas9基因编辑系统时,需要构建出表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒,质粒中插入抗药基因表达盒,借助转染技术将质粒运送至细胞,再用药物筛选出稳定表达细胞系,进行基因编辑研究。这种编辑方法比传统方法更简便和省时,目前已经应用在各种生物领域。本研究以CRISPR/Cas9系统中的关键结构之一的sgRNA为研究对象,构建出贾第虫sgRNA瞬时和稳定转染载体。实验分析了已发表文章的锥虫和弓形虫中的敲除载体中的功能元件,并预测了贾第虫U6启动子,将锥虫U6、弓形虫18S rRNA的两种外源启动子和预测的贾第虫内源的U6启动子作为sgRNA的候选启动子来启动sgRNA的转录。以pBluescript II SK(+)为真核转染载体骨架,将三种sgRNA表达盒插入pBluescript质粒,构建且鉴定成功后,利用质粒大提的方法将三种质粒提取纯化,通过电穿孔的方式将质粒转染入贾第虫细胞中,转染并培养24 h后提取滋养体总RNA,反转录得到cDNA,qPCR分析三种启动子的启动效果和能力。鉴定成功的质粒再通过电转染至贾第虫之后,取不同时间点进行qPCR检测,分析瞬时转染sgRNA的表达时间。为检验3’UTR对sgRNA的转录是否有影响,本研究将U6的3’UTR用插入到瞬时转染载体中sgRNA基因的3’端,构建出pBSK-GU5-sgRNA-GU3质粒,将pBSK-GU5-sgRNA和pBSK-GU5-sgRNA-GU3两种质粒通过电转染贾第虫后,用qPCR技术分析两种载体的sgRNA的表达量。在鉴定成功的转染载体内插入NEO表达盒构建出稳定转染载体pBSK-GU5-sgRNA-RNR,同时通过G418浓度梯度培养贾第虫来确定G418对贾第虫的最小致死量。用内切酶将稳定转染质粒线性化并回收之后用电转染至贾第虫内,在含G418药物的培养基中筛选出sgRNA稳定表达虫株,提取基因组DNA,PCR鉴定NEO和sgRNA基因。通过以上研究,本研究成功构建出sgRNA瞬时转染载体,并用qPCR技术检测到sgRNA成功被贾第虫U6启动子转录,其瞬时表达时间为6 d,再插入NEO表达盒构建出稳定转染载体,通过转染之后的G418药物筛选,本研究成功得到稳定表达sgRNA的抗G418虫株,并用PCR方法鉴定出sgRNA及NEO基因,表明稳定转染实验成功。本研究同时通过实验证明贾第虫U6的3’UTR对sgRNA的转录表达无显著影响。本研究通过预测及筛选分析,成功得到贾第虫内源性sgRNA启动子,在贾第虫内成功地进行瞬时转染和稳定转染,为CRISPR/Cas9系统在贾第虫中的成功建立及利用该技术对贾第虫基因功能的进一步研究提供理论依据。
【图文】：

贾第虫,集聚体,分型,感染率

图 1-1 贾第虫的集聚体及感染人类的分型[10]Fig. 1-1 The assemblage of Giardia and typing of infected humans[10].2 贾第虫的流行病学贾第虫病在世界范围内普遍存在，患者的主要病状是腹泻，除此之外还可有腹痛、和吸收不良的临床症状。慢性感染患者常为无症状。发病症状常在感染初期的第]。全世界国家和地区的感染者比例为 1%~30%，每年大约有 2.8 亿人感染。其中发染率为 0.2%~29.2%，而在发展中国家贾第虫感染率普遍较高，可达到 8%~30%[18-间差异较大的主要的原因是贾第虫主要是水源性传播，发展中国家经济和卫生条件贾第虫的传播较广泛，易呈暴发性流行。在美国，人们将贾第虫列为头号危险肠道而在加拿大、澳大利亚等发达国家，也存在有贾第虫流行，甚至是大流行。发展中者占主要数量，贾第虫感染率在马来西亚为 16%~18%，在乌干达甚至达到 40.7%[感染在我国各个城市和地区均有分布，感染率为 0.4%~16.2%[22]，每年约有 2850 万，超过全球总感染者的 10%[23,24]。总体来讲，我国国内的沿海和西部地区的贾第虫高；农村居民比城镇居民感染率高；儿童比成人感染率高。其原因主要是沿海地区，，利于贾第虫的传播；偏远地区及农村卫生环境较差，习惯饮用生水；儿童卫生习

贾第虫,生活史

图 1-2 贾第虫生活史[36]Fig. 1-2 The life cycle of Giardia[36]4 贾第虫的致病机制贾第虫病是一种由多个原因导致的疾病，反应了宿主与寄生虫之间复杂的相互作是非侵入性的感染，附着在小肠的上皮细胞进行复制繁殖。目前对引起贾第虫病完全清楚，贾第虫对寄主上皮细胞有一定的损伤作用，这是一个受宿主遗传变异免疫因素影响的过程。贾第虫附着在上皮细胞，释放效应分子进入细胞胞浆，并特别是膜破坏毒素。贾第虫在宿主上皮细胞的附着程度是决定这些的毒力的重要第虫与宿主细胞接触时会产生有害物质。研究人员在贾第虫中发现了几种分泌产认为可帮助贾第虫滋养体黏附在人类的肠道上。在贾第虫建立可用于基因敲除研统，可帮助建立或确认已知或假定的毒力因子的作用[37]。贾第虫病的发病时间通 7~12 天之后，患者感染后常见的临床症状是腹泻（有时带有吸收不良综合征）、和体重减轻[38]。感染者中有些人仅有很轻微的症状并能够自愈；另一些感染者则严重的病症，并且在经过常规治疗之后不能实现治愈。大多数的感染者是处于这慢性贾第虫感染可导致肠易激综合征（IBS）、食物过敏、关节炎或慢性疲劳综合
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.72

【相似文献】