表皮生长因子受体EGFR在PEDV感染中的调控作用及机制研究

发布时间：2020-04-23 13:09

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性的肠道传染病,在临床上主要表现为猪的呕吐、腹泻和脱水,其中仔猪死亡率高达100%,严重威胁国内外养猪业的经济发展。尽管对PED的报道已有四十多年的历史,但有关该病的致病机制却知之甚少。本研究发现,PEDV感染细胞后可以引起表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的磷酸化,提示病毒感染可激活EGFR。已有文献报道EGFR在某些病毒感染中发挥重要作用,因此我们对EGFR在PEDV感染中的作用进行了解析。首先,我们运用EGFR配体EGF(Epidermal Growth Factor)特异性激活EGFR后测定其对PEDV感染的影响,结果显示活化的EGFR提高了病毒RNA水平和病毒滴度,表明EGFR可促进病毒感染。同时,EGFR过表达实验证实当EGFR功能增强时,病毒的感染效率增强,这提示EGFR参与PEDV感染。我们使用EGFR特异性抑制剂Erlotinib和Gefitinib进一步测定EGFR对PEDV感染的影响。间接免疫荧光检测结果表明EGFR抑制剂显著降低PEDV的感染效率,western blot、相对荧光定量PCR和TCID_(50)结果证明随着抑制剂浓度升高,病毒蛋白表达水平、RNA水平和病毒滴度逐渐降低。此外,我们引入EGFR特异性siRNA,western blot结果证明EGFR内源性表达被敲低后可以抑制病毒蛋白的合成,相对荧光定量PCR和TCID_(50)实验结果也显示EGFR表达量降低后病毒的RNA水平和滴度显著降低。上述实验结果证实在PEDV感染中,EGFR发挥重要作用。因此,我们对EGFR影响PEDV感染的分子机制进行了探索。首先,使用EGFR特异性的siRNA检测其对IFN-I的影响。相对荧光定量PCR结果显示敲低EGFR后IFN-I相关基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平均明显升高,表明抑制EGFR活性可以恢复细胞抗病毒活性来抑制PEDV感染。进而我们检测PEDV感染后EGFR下游分子STAT3的变化情况,western blot结果表明在PEDV感染中,STAT3也被磷酸化,提示病毒感染激活了EGFR及其下游分子STAT3。运用STAT3抑制剂或者STAT3特异性siRNA抑制STAT3活性或表达,相对荧光定量PCR结果显示当抑制STAT3功能时,干扰素相关基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平明显升高,提示抑制STAT3活性可促进干扰素产生。相对荧光定量PCR和western blot检测过表达STAT3对PEDV感染的影响,结果显示提高STAT3表达水平提高了PEDV的RNA和蛋白水平,表明STAT3的活化可促进PEDV的感染。最后,我们运用特异性siRNA敲低STAT3表达结合EGF处理激活EGFR的方法检测EGFR介导的促进病毒感染与STAT3的相关性。Western blot结果显示由EGFR活化引起的PEDV N蛋白增加却因STAT3的敲低而受到抑制,表明病毒感染诱导的EGFR活化可通过其下游分子STAT3介导的信号通路来拮抗细胞的抗病毒反应。本研究首次证明EGFR在PEDV感染中的作用,阐明了一种新的PEDV逃避机体抗病毒反应的机制,可能作为PEDV感染的治疗靶点。
【图文】：

基因结构,纤突蛋白

图 1.1 PEDV 基因结构图(Lee C, 2015)Figure 1.1 Genome structure of PEDV图 1.2 PEDV 结构模式图(Lee C, 2015)Figure 1.2 Model of PEDV structure在 PEDV 所编码的这些蛋白中，S 基因编码的 S 蛋白为病毒粒子表面的纤突蛋白，被认为是最重要的病毒表面抗原，在 PEDV 识别靶细胞和在细胞膜融合的过程中发挥着重要作用(Bosch B

序列,结构模式,蛋白

图 1.2 PEDV 结构模式图(Lee C, 2015)Figure 1.2 Model of PEDV structure些蛋白中，S 基因编码的 S 蛋白为病毒粒在 PEDV 识别靶细胞和在细胞膜融合的过 et al., 2008)，这种相互作用能够刺激宿主机很强的预防作用(Chang S H, et al., 2002; G, et al., 2010)。在病毒入侵细胞时，，S 蛋白内毒力的强弱(Sato T, et al., 2011)。研究发为 COE 序列。COE 序列中任何一个氨基白除了可以用来分析其分子流行病学外，产中(Chen Q, et al., 2014; Gerber P F, et al.,14)。E 基因编码的蛋白称为 E 蛋白，也称表面，在病毒的自我组装以及病毒粒子的中，该蛋白的恒定表达促进内质网发生l., 2013)。M 基因编码的 M 蛋白可以将病挥重要作用，M 蛋白和 E 蛋白相互作用可
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

【参考文献】