复方中药对鸡大肠杆菌病的治疗效果及其机理研究

发布时间：2020-04-27 21:42

【摘要】：鸡大肠杆菌病是鸡的常发病,每年都给养殖生产造成严重损失。抗菌药物是控制鸡大肠杆菌病的重要手段之一。随着细菌耐药性、药物残留等问题在世界范围内日益严重,欧盟等发达国家已率先禁止使用抗菌素类饲料添加剂,我国也在逐步规范和限制抗菌药物的使用,在食品动物中限制使用抗菌药物在世界范围内将是必然趋势。鸡大肠杆菌病的主要病理变化为全身多器官炎症,根据全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)理论,干预炎症发生与发展是治疗鸡大肠杆菌病的关键环节之一。许多中药通过干预炎症、提高机体免疫力等多种方式对多种疾病表现出积极作用,且具有低残留、不易耐药等优势,是防治畜禽大肠杆菌病的有效方案之一。本论文结合文献与生产实际需求,以抑菌、抗炎作用优良的中药组成复方中药制剂,以鸡大肠杆菌病模型为研究对象,评价复方中药治疗效果,探讨治疗机制,研究结果将对临床防治鸡大肠杆菌病具有重要的理论与实践指导意义。1、采用纸片法和试管二倍稀释法分析O_2型鸡大肠杆菌临床分离株对青霉素类药物(阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸)、头孢菌素类药物(头孢噻呋)、氨基糖苷类药物(庆大霉素)、四环素类药物(四环素、多西环素)、喹诺酮类药物(环丙沙星、恩诺沙星)等5类8种抗菌药物的敏感性,并采用纸片扩散法分析O2型鸡大肠杆菌临床分离株的ESBLs属性。8种抗菌药物抑菌圈直径和最小抑菌浓度分别为阿莫西林(16.4±2.1mm、64μg/mL)、阿莫西林/克拉维酸(19.8±1.39mm、4μg/mL)、头孢噻呋(22.9±0.56mm、1μg/mL)、庆大霉素(15.3±0.22mm、32μg/mL)、四环素(12.3±1.42mm、32μg/mL)、多西环素(10.9±0.9mm、32μg/mL)、环丙沙星(13.2±1.3mm、8μg/mL)、恩诺沙星(25.1±1.64mm、0.25μg/mL)。两对检测底物抑菌圈直径相差均大于5mm。结果表明该O_2型鸡大肠杆菌临床分离株对阿莫西林、四环素、庆大霉素、多西环素和环丙沙星呈现高度耐药,对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋和恩诺沙星敏感,为产ESBLs多重耐药菌;2、采用PCR法扩增O_2型鸡大肠杆菌临床分离株质粒可能携带的耐药基因。结果表明该O_2型鸡大肠杆菌临床分离株携带一种AmpC基因(CMY),两种ESBLs基因(CTX-M、TEM),两种氟喹诺酮类耐药基因(qnrC、qepA),两种氨基糖苷类耐药基因(armA、rmtB),两种四环素类耐药基因(tetA、tetB),该结果与其耐药表型基本一致,提示O_2型鸡大肠杆菌临床分离株的耐药性可能是其质粒携带的耐药基因介导的;3、采用平板打孔法和试管二倍稀释法分析10味中药对O_2型鸡大肠杆菌临床分离株的抗菌作用,采用二甲苯致小鼠耳肿胀法分析10味中药的抗炎作用。10味中药最小抑菌浓度、抑菌圈直径以及对肿胀鼠耳的肿胀抑制率结果分别为鱼腥草(62.5mg/mL、9.8±0.15mm、31.19±0.06%)、黄连(7.81mg/mL、18.3±0.04mm、22.1±0.04%)、黄芩(62.5mg/mL、14.4±0.12mm、42.29±0.05%)、穿心莲(31.25mg/mL、14.6±0.17mm、56.3±0.04%)、苦参(15.63mg/mL、13.6±0.15mm、39.49±0.09%)、金银花(31.25mg/mL、12.8±0.16mm、28.4±0.06%)、苍术(0.5g/L、6.8±0.22mm、36.19±0.1%)、甘草(62.5mg/mL、7.4±0.13mm、33.8±0.13%)、连翘(15.63mg/mL、16.5±0.24mm、47.49±0.05%)、板蓝根(31.25mg/mL、12.4±0.1mm、33.5±0.1%)。根据该结果,拟选用抗菌、抗炎作用优良的穿心莲、黄连、连翘组成复方中药展开进一步试验;4、采用两步法测定O_2鸡大肠杆菌临床分离株对试验鸡的ID_(50),并建立鸡大肠杆菌人工感染模型。在此基础上,采用正交试验法,以治疗鸡大肠杆菌病的总有效率为考察指标,优化穿心莲、黄连、连翘的最佳配伍比例。结果表明穿心莲和黄连对总有效率影响显著(P0.05),连翘影响不显著,三味中药最优剂量组合为穿心莲70g、黄连70g、连翘50g;5、采用平板打孔法和试管二倍稀释法检测复方中药对O_2型鸡大肠杆菌临床分离株的抗菌作用。结果显示复方中药对O_2型鸡大肠杆菌临床分离株的抑菌圈直径和最小抑菌浓度分别为16.3±0.11mm和15.63mg/mL,提示O_2型鸡大肠杆菌临床分离株对复方中药高度敏感;进一步研究的结果表明,复方中药抗菌机制可能与其破坏菌体结构,抑制细菌呼吸代谢有关;6、采用人工感染鸡大肠杆菌病模型考察复方中药的治疗作用。结果显示,高剂量复方中药能够提高试验鸡相对增重率(47.77%),提高鸡大肠杆菌病的治愈率(62.5%)和总有效率(87.5%),降低鸡大肠杆菌病的发病率(26.67%)。在上述方面,高剂量复方中药组均极显著(P0.01)或显著(P0.05)地优于攻毒对照组,与抗生素对照组差异不显著;7、初步探讨复方中药对鸡大肠杆菌病的治疗机制。结果显示,与对照组相比,复方中药能不同程度降低外周血中转录因子TLR4、NF-κB,促炎因子TNF-α、IL-1,炎症趋化因子IL-8、TGF-β4和免疫调节因子IFN-γ含量及其mRNA表达水平,提高外周血中IL-10含量及其mRNA表达水平;极显著地提高或降低发病鸡的免疫器官指数(P0.01),降低IFN-γ/IL-4比值。提示复方中药是通过干预炎症、提高鸡体免疫水平以及纠正免疫平衡等方式抵抗鸡大肠杆菌感染。结论:1、供试O_2型鸡大肠杆菌临床分离株为产ESBLs的多重耐药菌株,对阿莫西林、四环素、多西环素、庆大霉素、环丙沙星等5种抗生素高度耐药,耐药表型与质粒携带耐药基因一致;2、O_2型鸡大肠杆菌临床分离株对复方中药(穿心莲70g、黄连70g、连翘50g)敏感,其机制可能与其破坏菌体结构,抑制细菌呼吸代谢有关;3、复方中药可显著降低鸡大肠杆菌病发病率,提高鸡大肠杆菌病治愈率及总有效率,改善大肠杆菌病发病鸡只相对增重率;高剂量组复方中药治疗效果与复方阿莫西林克拉维酸相当;4、复方中药可影响炎症因子的转录与表达,干预和调节炎症反应,改善发病鸡的免疫功能;5、复方中药对鸡大肠杆菌病的治疗作用可能与其抗菌、抗炎和免疫调节作用有关。
【图文】：

头孢菌素类药物,头孢噻呋,喹诺酮类药物,稀释法

鸡大肠杆菌临床分离株麦康凯培养ken E. coli clinical isolates cultured i临床分离株对抗菌药物的稀释法检测 O2型鸡大肠杆菌临床、头孢菌素类药物（头孢噻呋）、氨西环素）、喹诺酮类药物（环丙沙星结果如图 3-2 见表 3-1。法检测 O2型鸡大肠杆菌临床分离

纸片法,药物敏感性,头孢菌素类药物,头孢噻呋

复壮菌株活力良好。2型鸡大肠杆菌临床分离株麦康凯培养基培养hicken E. coli clinical isolates cultured in MacC杆菌临床分离株对抗菌药物的敏感量稀释法检测 O2型鸡大肠杆菌临床分离株酸）、头孢菌素类药物（头孢噻呋）、氨基糖苷多西环素）、喹诺酮类药物（环丙沙星、恩诺试验结果如图 3-2 见表 3-1。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31

【参考文献】