TLR2,NLRP3在钩端螺旋体感染过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-30 18:34

【摘要】：钩端螺旋体(钩体)分为致病性问号钩体和非致病性腐生型双曲钩体两类。钩体病是由致病性的钩体引起的一种广泛传播的自然疫源性人畜共患病,猪、马、牛、羊以及人类都可感染此病,引起发热、黄疸、流产甚至死亡,给我国畜牧业生产和人类健康造成了极大危害。到目前为止,钩体病的详细发病机理还不能被完全阐明。钩体侵入动物体后,能迅速扩散至全身各个组织器官。天然免疫系统是机体对病原菌识别防御的第一道防线。研究宿主天然免疫系统对钩端螺旋体的识别及反应机制,对钩端螺旋体病的防治具有重要意义。研究发现钩体能够激活细胞表面的模式识别受体——TLR2和TLR4,也可以激活胞内的模式识别受体——NLRP3。TLR2,TLR4的激活能启动核转录因子Nf-κB和MAPK信号通路,使细胞因子IL-1β,IL-6,TNF-a等大量表达。而NLRP3炎性体的激活需要两个信号,第一个信号是TLRs介导的炎性细胞因子转录合成,第二个信号是通过与接头蛋白ASC结合,并招募Pro-caspase-1形成为炎性小体‖的复合物,激活caspase-1,从而对Pro-IL-1β等底物进行切割,使其成熟并释放到胞外。应用小鼠基因缺陷模型,已经发现缺陷TLR4或同时缺陷TLR2和TLR4的小鼠感染钩体后迅速死亡,但对于金黄地鼠及其他敏感动物来说,他们体内并不缺陷TLR2和TLR4,这些敏感动物在钩端螺旋体感染过程中,其体内的TLR2和TLR4到底发挥了怎样的功能还不清楚。由于钩体可以迅速穿透细胞膜,进入胞内,那么除NLRP3以外,胞浆中的其他炎性体是否也能识别侵入胞内的钩体呢?耐受动物与敏感动物感染钩体后,这些受体的作用是否也有差异?对这些问题的解答将进一步揭示钩体的致病机制,为开发新的靶向防控生物制剂奠定理论和实验基础。因此,本论文从先天免疫识别受体的角度出发,通过对比钩体感染的两种动物模型——金黄地鼠敏感模型和小鼠耐受模型,探索TLR2、TLR4以及胞内炎性体(NLRP3、NLRC4)在钩端螺旋体感染过程中发挥的作用及机制,进而探究以调节TLR2,TLR4及NLRP3、NLRC4炎性体信号通络为靶点的药物在抗钩端螺旋体感染中的应用价值。结果显示,钩体感染后,金黄地鼠体内TLR2的表达要明显滞后于BALB/c小鼠,而TLR4的表达没有明显的差异,因此,TLR2前期不表达或不激活可能是金黄地鼠对钩体易感的原因。为了验证上面的假设,TLR2缺陷的C57小鼠被用来接种钩体,同时,用TLR2的激动剂Pam3CSK4来治疗感染钩体的金黄地鼠,发现TLR2缺陷加重了小鼠感染钩体后的病理变化,相应的,应用TLR2激动剂Pam3CSK4则提高了金黄地鼠感染钩体后的存活率,表明TLR2的前期激活能有效控制钩体感染。为进一步探索TLR2发挥作用的分子机制,分析比较了TLR2下游的细胞因子在两种动物模型中的表达差异,并检测了IL-10/TNF-α比值在野生型和TLR2缺陷型C57小鼠中,以及Pam3CSK4处理的金黄地鼠中的变化情况。发现TLR2的表达与IL-10有一定的协同性,并通过细胞实验进一步证明钩体引起的IL-10表达是由TLR2介导的。以上实验结果表明,TLR2的激活能有效控制钩体感染,该过程可能是通过提高IL-10水平或IL-10/TNF-α比值来实现的。对比金黄地鼠和C57小鼠感染钩体后NLRP3和NLRC4基因的表达差异,发现金黄地鼠中NLRP3的表达明显滞后于小鼠,而NLRC4在两种动物感染前期都不表达,后期表达差异不大,表明NLRP3的差异表达可能是造成小鼠和金黄地鼠模型不同转归的原因。随后,应用NLRP3缺陷的C57小鼠,发现虽然野生型和NLRP3缺陷小鼠感染钩体后存活率没有差异,但NLRP3缺陷鼠体内的钩体量更低,组织病理变化更缓和,并且器官中IL-1β的水平与体内钩体量不相关,提示NLRP3缺陷后对钩体清除作用的加强并不依赖下游的IL-1β。为进一步证明以上观点,提取NLRP3、NLRC4、Caspase-11、Caspase-1-11缺陷的C57小鼠的腹腔巨噬细胞,进行感染实验,发现钩体引起的IL-1β主要依赖NLRP3炎性体,应用双醋瑞因(IL-1β抑制剂)来治疗感染钩体后的C57小鼠和金黄地鼠,却没有提高感染钩体后小鼠和金黄地鼠的存活率,而且也没有降低小鼠体内的钩体含量,表明NLRP3缺陷后对钩体清除作用的加强并不依赖下游IL-1β的降低。NLRP3除介导IL-1β的成熟外,还能影响细胞自噬,NLRP3缺陷后对钩体的清除作用的加强是否依赖于细胞自噬水平的提高呢?本实验中NLRP3缺陷明显提高了C57小鼠肾脏的自噬水平。尽管金黄地鼠感染钩体后NLRP3的表达滞后于C57小鼠,但体内自噬水平并没有升高,反而远远滞后于C57小鼠,以上实验结果表明,NLRP3缺陷能加速体内钩体的清除,该过程可能是通过提高细胞自噬水平来实现的。为了进一步验证TLR2和NLRP3在控制钩体感染过程中的作用,选择当前治疗钩体病的首选药物--多西环素进行了体内体外验证。发现多西环素在治疗钩体病时,除发挥一般的抗菌作用外,还能特异性的抑制IL-1β的表达和分泌,并且能够提高宿主TLR2的表达,同时抑制NLRP3的表达,进一步研究表明,多西环素还抑制了TLR2下游的NF-κB和MAPK信号通路,并且抑制了NLRP3炎性体激活的Priming阶段,以上结果通过多西环素间接证明,提高TLR2,抑制NLRP3,有助于钩体病的治疗。综上所述,TLR2和NLRP3在钩体感染过程中发挥了重要作用。TLR2的激活能有效控制钩体感染,该过程可能是通过提高IL-10水平或IL-10/TNF-α比值来实现的。NLRP3缺陷能加速体内钩体的清除,该过程可能是通过提高细胞自噬水平来实现的。多西环素提高了钩体引起的TLR2的表达,同时抑制了NLRP3的表达及NLRP3炎性体激活的priming阶段。提示应用能够提高TLR2,抑制NLRP3表达的药物可能有助于钩体病的治疗。
【图文】：

途径,图片

图 2.1 钩体的补体逃避途径（图片引自：Fraga T R, BarbosaAS, Isaac L. Leptospirosis: aspects of innaunity, immunopathogenesis and immune evasion from the complement systeScandinavian journal of immunology, 2011, 73(5): 408-419.）Fig 2.1 Complement escape of leptospira除了将 FH 吸引到表面之外，钩体还能结合人的 C4BP（经典和凝集补的一种关键抑制剂）[105]。致病性钩体能从人的血清中获得大量的 C4BP力的钩体，如 Patoc，仅能捕获少量的 C4BP。结合到钩体表面的 C4BP性，说明有毒力的钩体可能通过捕获这种补体通路调节剂来抵抗血清的。最近，，发现钩体外膜蛋白中存在一个 20-KDa 的 LcpA，可以与补体通直接结合[106]，部分或完全抵抗补体杀伤途径的钩体表达 LcpA，并将其体表面，捕获人血清中的 C4BP，C4BP 与 LcpA 结合后，仍有活性，作

模式识别受体,炎性

图 2.2 模式识别受体对钩体的识别Fig 2.2 Pattern recognition receptors and leptospira2.2.2 胞内炎性体对钩体的识别除 TLR2 和 TLR4 外，钩体还能激活胞内的 NLRP3 炎性体[138]（图 2-2）。炎性复合体（Inflammasomes）是由胞浆内模式识别受体 NLRs 和 ALRs 家族成员参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。目前已鉴定出NLRP3、NLRP1、NLRC4 和 AIM2 等多种炎性体，其各自的装配形式及对革兰氏阴性菌的识别及功能如图2-3所示，其中NLRP3炎性体的研究最为深入[139-141]。研究发现，NLRP3 炎性复合体由 NLRP3、接头蛋白 ASC 和 Caspase-1 组成，可以被细菌PAMPs和毒素[142-145]、病毒[146-149]，真菌[150-152]，寄生虫[153]，以及ATP[142]、尿酸单钠结晶[154]、淀粉样纤维 B[155]等 DAMPs 激活，从而激活半胱氨酸蛋白酶
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.99

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