绒山羊毛乳头细胞全转录组学分析及与毛母质细胞分子互作机制的研究

发布时间：2020-05-02 16:58

【摘要】：毛发是哺乳动物最为显著的外在特征之一,是由嵌入皮肤内的迷你器官—毛囊所产生。毛囊主要由真皮层和表皮层两类细胞构成,其中属于真皮层的毛乳头细胞是毛囊的“信号中心”,它们通过分泌诸多生长因子和细胞因子等信号分子控制着毛囊表皮层细胞的增殖和分化。属于表皮层的毛母质细胞是形成毛发各类细胞的前体细胞,它们是在毛囊干细胞被激活后迁移到毛囊毛球部所形成的细胞群体,其快速增殖和终末分化最终形成持续不断生长的毛发。绒山羊是我国重要的绒毛用经济动物之一,探索毛囊发育的分子机制是提高绒毛产量和质量的基础性工作。因此,了解毛乳头细胞信号分子表达调控和毛母质细胞增殖及分化的相关机理是解析毛囊发育的关键科学问题。本研究旨在获取毛乳头细胞的全转录组表达谱数据,并探索毛乳头细胞和毛母质细胞间信号互作的分子机制,为上述科学问题的解决提供参考信息。本研究内容共包括:1)分离培养绒山羊毛囊毛乳头细胞和成纤维细胞,建立起两类细胞的全转录组学数据,通过比较分析筛选影响毛囊发育的编码基因和非编码基因;2)探索与筛选到的功能基因CRABP1和LEPR相关的小分子物质全反式视黄酸和瘦素在毛乳头细胞内的功能;3)建立并优化毛母质细胞体外培养的技术体系;4)通过细胞共培养和RNA-seq技术探索毛乳头细胞和毛母质细胞分子互作的机制。主要研究成果如下:1.成功地采用显微解剖法和组织块培养法分别获取了绒山羊的毛乳头细胞和皮肤成纤维细胞;两类细胞具有显著不同的形态特征,毛乳头细胞呈扁平状和多角形,而成纤维细胞呈细长的纺锤丝状;对两类细胞进行全转录组学建谱共鉴定到mRNAs43766条,lncRNAs 2540条,TUCP 759条,miRNAs 536条,circRNAs 3706条。2.毛乳头细胞和成纤维细胞共存在差异表达mRNAs 2538条,其中毛乳头细胞中表达上调1286条,下调1252条;lncRNAs 71条,其中上调18条,下调53条;TUCP18条,上调3条,下调15条;circRNAs 121条,上调76条,下调45条;miRNAs86条,上调42条,下调44条;对毛乳头细胞中上调的基因及差异表达非编码基因的靶基因进行KEGG通路分析发现,粘附斑、胞外基质-受体互作和调节干细胞多潜能性信号通路等信号通路得到富集。同时,雌激素信号通路、脂肪因子信号通路和甲状腺激素信号通路等与激素相关的信号通路也得到富集。3.将绒山羊毛乳头细胞上调基因同小鼠毛乳头细胞的标记基因取交集分析发现25个核心基因,包括SPP1、LEPR、WNT5A、PTGFR、RSPO1、HOXC8和MAGED2等;进一步对涉毛囊干细胞激活相关的基因HOXC8和RSPO1进行分析发现,它们的表达可能受到chi-miR-144-5P、lnc_000335和lnc_001710等非编码基因的正向和负向调控;同时,一些特定的lncRNAs和circRNAs如XR_310320.3和chi_circ_000573可能会作为内源竞争性RNAs分子吸附抑制上述基因表达的miRNAs如chi-miR-144-5P等从而上调相关基因的表达。4.视黄酸信号通路相关基因CRABP1和RARβ高表达于毛乳头细胞内;外源性的全反式视黄酸抑制毛乳头细胞的活力,诱导毛乳头细胞的凋亡,增加毛乳头细胞处于细胞周期G1期的比例,而减少G2期比例;全反式视黄酸处理后毛乳头细胞中CRABP1和RARβ的表达量显著上调(P0.05),而FGF7表达量显著下调(P0.05);全反式视黄酸在转录水平抑制FGF7的表达,且RARβ在FGF7基因启动子区域存在8个结合位点。LEPR的mRNA和蛋白表达水平在毛乳头细胞中都显著地高于成纤维细胞;外源重组瘦素处理提高了毛乳头细胞的细胞活力,同时也显著地增加了FGF7和IGF-1的表达量(P0.05)。5.成功地采用显微解剖法分离培养了绒山羊毛母质细胞,原代和传代培养的毛母质细胞都呈典型的角质化细胞样的铺路石状形态;对培养条件优化发现,无钙RPMI1640是最优的培养基,而Coating Matrix和Collagen Type IV是最优的培养皿包被介质;毛母质细胞的体外倍增时间为23.60小时;毛母质细胞标记基因如HOXC13和SOX21等的表达在mRNA和蛋白水平显著地高于毛乳头细胞(P0.05)。6.钙离子促进毛母质细胞内角质化细胞分化相关基因loricrin、involucrin和KRT1的表达,提高了毛母质细胞的增殖比例,但对细胞周期没有影响。全反式视黄酸促进了毛母质细胞的增殖,减少毛母质细胞处于细胞周期G1期的比例,而增加了处于G2期和S期的比例;全反式视黄酸增加了毛母质细胞内CRABP1和RARβ的表达量(P0.05),也促进了involucrin基因的表达(P0.05)。7.Transwell直接共培养改变了毛乳头细胞和毛母质细胞的细胞周期分布,体现在共培养的毛乳头细胞处于S期的细胞比例显著地高于单独培养的毛乳头细胞(P0.05)。同时,共培养的毛母质细胞处于G1期细胞比例显著减少(P0.05),G2期和S期显著增加(P0.05)。8.共培养改变了两类细胞的基因表达模式,体现在共培养条件下毛乳头细胞上调基因3358个,包括已知的功能基因如FGF7、FGF10、WNT5A和IL-6等,下调基因2843个。共培养时毛母质细胞上调基因3436个,包括诱导毛乳头细胞表达生长因子的基因IL-1A等;下调基因3059个,包括编码角蛋白的基因如KRT17等和对角蛋白表达起调控作用的基因如HOXC13等。综上所述,本研究通过对毛乳头细胞和成纤维细胞进行全转录组建谱和分析筛选到了大量影响毛囊生长和发育的候选编码和非编码基因,并构建了非编码基因对关键编码基因的调控关系和互作网络;通过挖掘相关数据,本研究探索了全反式视黄酸和瘦素对毛乳头细胞体外培养的作用,为进一步阐述它们对毛囊的影响提供了理论基础。同时,本研究还成功地建立并优化了毛母质细胞的体外培养体系,并借此探索了毛乳头细胞和毛母质细胞体外互作的分子机制,为进一步探索毛囊发育的分子机制提供良好的细胞模型和可靠的候选基因。
【图文】：

图 1-1 哺乳动物毛囊形态发生的一般过程及关键分子(Schmidt-Ullrich and Paus 200Figure 1-1 Processes and the key molecules of the morphogenesis of animal hair follicle通过以小鼠为模型进行基因敲除或敲入等基因操作，研究人员发现了大量的发生相关的信号分子及通路如 Wnt/β-catenin、Eda/Edar、FGFs、TGFβ/B13 等(Millar 2002; Stenn 2003; Madaan et al. 2018)。K14 基因启动子驱动的 路抑制因子 Dkk1 的异位表达会导致毛囊形态转变和细胞分化之前的基板形而且还阻止了类似毛囊的结构如牙齿和乳腺在毛芽阶段之前的发育(And)。Edar 基因的突变也有类似的效应，会致使小鼠毛发在形态发生过程中没成，机制是导致基板特异性基因如 Bmp4、Lef1 和 Shh 等的表达缺失(Laurik02)。此外，Lef1、Noggin、Shh 和 Gli2 等都与毛囊的形态发生过程有密切的它们在毛囊形态发生不同阶段所起的作用是不同的(Zhou et al. 1995; Chian; Botchkarev et al. 2002; Mill 2003)。类似的机制也出现在绒山羊毛囊的发育过Gao等(2016)通过转录组测序技术对不同阶段绒山羊胎儿皮肤的基因表达谱现，HOXC13、LHX2、MSX2 和 PAD3 等同小鼠毛囊角质化细胞分化相关的羊毛囊发育的不同阶段差异性表达，说明这些基因都也参与了绒山羊毛囊发

图 1-2 毛囊周期循环示意图(Alonso 2006)Figure 1-2 The hair cycle1.2 毛乳头细胞研究进展毛乳头细胞是位于毛囊底部的一类特化的成纤维细胞，，它们在毛囊形态发生和周期循环中有举足轻重的作用，被认为是毛囊的“信号中心”(Karlsson et al. 1999; Kulessa eal. 2000)。它们不仅决定着毛囊的周期性发育，还影响着毛囊的大小及毛发纤维的粗细等(Yano et al. 2001; Driskell et al. 2012; Morgan 2014)。毛乳头细胞也可以作为许多激素、神经小肽、小分子化合物及神经递质等诸多小分子物质的靶标，进而间接性地参与这些激素类物质对毛囊周期的调控(Oh and Smart 1996b; van Beek et al. 2008; Paus et al. 2014Toyoshima and Tsuji 2017)。此外，困扰人类群体的雄性脱发疾病也与毛乳头细胞促进毛囊角质化细胞的增殖和分化功能的缺失有关(Inui et al. 2002, 2003; Inui and Itam2011)。因此，毛乳头细胞参与毛囊生物学各个方面的分子机制得到研究人员广泛的关注(Madaan et al. 2018)。同时，研究人员也建立起了毛乳头细胞体外培养的技术体系，
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827


本文编号：2647287