外泌体在MDV感染中的作用研究

发布时间：2020-05-08 11:23

【摘要】：鸡马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的恶性淋巴增生性肿瘤疾病,严重危害养禽业的发展。MDV有3个血清型,其中1型为致瘤型,主要破坏T细胞,可引起免疫抑制。国内外学者对MDV的致瘤机制做了大量的研究,但具体的机制还不是很清楚。外泌体是一类直径介于30nm-150nm之间的由细胞分泌的细胞外小囊泡,可携带蛋白、microRNA(miRNA)等成分,在细胞间物质交换和信号传递中起重要作用。miRNA是一种长度仅有19-25nt左右的非编码小RNA,其本身的生产加工成熟机制及功能已获得巨大的研究成果。特别是在人类癌症疾病中,miRNA在癌症疾病中不仅可以作为癌基因,也可作为肿瘤抑制因子,还可作为癌症标志物。其靶向肿瘤抑制因子时,当其上调可抑制靶向的抑癌基因,促进癌症的发展。近几年研究也发现,外泌体可通过直接或间接的作用影响肿瘤的发展及肿瘤细胞的迁移。PTEN是近年来发现的一种重要的抑癌基因,是P13K/Akt/mTOR信号通路中的一种负调节因子,多年来的研究发现,PTEN影响肿瘤细胞的分化、增殖、生长、迁移及凋亡。PTEN在人类疾病的研究中十分常见,但是对于禽类癌症的研究却极其稀少。那么MD作为禽类肿瘤的模型,在MDV感染过程中,外泌体及其组分在MD发生发展中起什么作用,靶向PTEN的miRNA有哪些,又是如何作用的呢?本研究以MDV为研究对象,分别从感染了马立克强毒株MD5的鸡胚成纤维细胞(CEF)和未感染的CEF培养上清中分离纯化外泌体,质谱(MS)和Western blot分析表明,MDV感染的细胞外泌体中含有MDV的病毒蛋白VP22,PP38,gB等成分,细胞增殖试验发现,外泌体可以刺激鸡脾细胞增殖;高剂量的细胞外泌体可以诱导淋巴细胞IFN-y分泌;流式细胞术检测发现MDV感染的细胞外泌体抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞。外泌体高通量测序结果表明,MDV感染与未感染病毒细胞上清外泌体中相比有26个miRNA上调,257个miRNA下调,其中预测靶向PTEN的miRNA有3个,分别为miR-74、miR-72、miR-43,进一步试验发现miR-43可能靶向PTEN。过表达miR-43后,PTEN的mRNA水平下调,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,为接下来确定miR-43与PTEN的靶向关系奠定了基础,也为MDV的致瘤机制研究提供了新的方向。
【图文】：

透射电镜,透射电镜

已知细胞培养基中的外泌体较于血液中的外泌体而言偏少，且不同细胞分泌的外逡逑泌体，其大小可能会不同，但是从透射电镜中观察其形态，都会有类似“茶杯托”的形逡逑状。图１－１Ａ电镜显示，ＭＤＶ感染和未感染的ＣＥＦ细胞上清中可观察到典型的杯状形逡逑态的囊泡，大小约３０－１００ｎｍ。感染组的细胞上清所提取的外泌体接种ＣＥＦ，未产生细逡逑胞病变，表明所提取的外泌体中不含ＭＤＶ病毒粒子，如图１－１Ｂ。逡逑３．２邋ＢＣＡ测定外泌体浓度逡逑本试验运用ＢＣＡ邋（碧云天）检测试剂盒测定出所提取的外泌体的浓度，根据公式计逡逑算正常ＣＥＦ提取的外泌体浓度约为１．０２ｍｇ／ｍｌ，邋ＭＤＶ感染的ＣＥＦ提取的外泌体浓度为０．９８逡逑ｍｇ／ｍｌ0逡逑

序列,蛋白,质谱法分析,表达差异

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｏｓｏｍｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｍａｒｋｅｒｓ逡逑验采用的是差速离心法提取细胞上清中的外泌体，为了验证提取的外ｌｏｔ方法检测外泌体表面标志物Ｈｓｐ７０，邋ＣＤ６３邋ａｎｄ邋ＣＤ９。图１－２显示，所能检测到外泌体的标志蛋白ＨＳＰ７０、ＣＤ９和ＣＤ６１。逡逑感染对ＣＥＦ细胞外泌体蛋白组成的影响逡逑一步鉴定来自不同ＣＥＦ来源的外泌体蛋白组成，通过质谱法分析外泌如图１－３所示。通过比对多肽序列与鸡和ＭＤＶ蛋白质文库，发现ｍｄ５正常ＣＥＦ外泌体相比有２８９种表达差异的蛋白，其中，１４７种上调（ｒａｔｉｏ调（ｒａｔｉｏ＜０．５）。且ｍｄ５感染的外泌体中包含２０种ＭＤＶ蛋白，包括特，糖蛋白ｇｂ，，被膜蛋白ＶＰ２２等，ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果与ＭＳ—致（图１－４
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31

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