Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及PCR-HRM分型方法的建立

发布时间：2020-05-10 15:55

【摘要】：包涵体肝炎(Inclusion Body Hepatitis,IBH)是由I群禽腺病毒(Fowl adenovirus I,FAV-1)引起的以侵害肝脏为主的家禽传染性疾病。该病的典型症状为心包积水、坏死性肝炎,主要感染3~6周龄的肉仔鸡,致死率高达80%。该病一旦发生,便可迅速向周围地区蔓延。近年来,在我国多个省市均有该病发生的报道,给我国家禽养殖业造成了巨大的经济损失。因此,加强对该病的研究有助于促进我国家禽养殖业的健康发展。本研究利用PCR方法从山东、江苏、陕西、河北等家禽养殖场送检的疑似“包涵体肝炎”的患禽肝脏组织中检测禽腺病毒,进行病毒分离以及Hexon基因测序,以了解我国部分地区I群禽腺病毒血清型的分布和感染状况。同时利用建立的PCR-HRM方法对分离的腺病毒实现准确、快速的基因分型,该方法可作为开发其他病原体基因分型技术的模型。本研究首先通过SPF鸡胚以及鸡胚肝细胞(CEL)两种分离方式对临床疑似腺病毒感染的肝脏组织进行病毒分离,通过PCR检测、血凝性鉴定、Hexon基因序列测定与分析等试验对病毒分离株进行鉴定。病料组织匀浆上清液接种SPF鸡胚后能导致胚体发育不良,体表潮红、出血,肝脏坏死、肿大,死亡高峰在接种后的6~7d;病料组织匀浆上清液接种鸡胚肝细胞(CEL),48h后部分细胞开始变圆、皱缩,72h后70%~80%的细胞开始脱落,呈葡萄样聚集,以上结果与报道的I群禽腺病毒的感染特性相符。PCR鉴定结果显示,扩增产物的目的条带与预期大小一致。共分离到15株I群禽腺病毒,分别命名为SD151225、SD150808、SD150930、SD150909、JS151208、SD160309、SD160402、SD160402、SD160318、SD160827、SD160720、SX160723、SD160826、SD160829、SD160930。并测定15株分离毒株的TCID_(50),分别在10~(-4.15)~10~(-7.5)之间。血凝试验结果显示分离毒株均无血凝性。采用PCR方法对15个分离毒株的Hexon基因进行扩增,并与GenBank中发表的I群禽腺病毒各血清型毒株的Hexon基因序列进行比对,结果显示,15个分离株中有10株与血清1型同源性较高,5株与血清4型同源性较高。遗传进化分析结果显示SD160827、SD151225、SD150808、SD150930、SD150909、JS151208、SD160309、SD160402、SD160401和SD160318分离株与血清1型禽腺病毒在同一分支上,其余分离株与血清4型禽腺病毒在同一分支上,说明15株FAV-I分离株可分为2个血清型,其中血清1型10株,血清4型5株。根据GenBank中发表的I群禽腺病毒各血清型毒株的Hexon基因序列,设计一条特异性引物,用于实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和随后的高分辨率熔解(High Resolution Melting,HRM)曲线分析,并确立了它在区分12种FAdV参考血清型方面的能力。将结果与之前的Hexon基因PCR结果进行比较,结果表明,PCR-HRM是区分I群禽腺病毒12种血清型的一种灵敏而特异的方法。所有的熔解曲线都具有高度的可重复性,使用归一化HRM曲线,每个血清型的复制都得到了正确的基因分型。本研究建立的I群禽腺病毒PCR-HRM检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于FAV-1的快速检测。
【图文】：

图 1 腺病毒衣壳结构（Chiocca et al., 1996）Fig. 1 Capsid structure of adenovirus (Chiocca et al., 1996).3禽腺病毒理化特性禽腺病毒的病毒粒子为不含有脂质的囊膜，因此对酚类、乙醚、脱氧胆脂酸、氯、胰蛋白酶及 5%的乙酸等常规化学试剂均不敏感。此外，该类病毒具有一定的耐热，室温下可存活 6 个月左右，干燥情况下 25℃可存活 7 天，60℃条件下加热 30m 50℃加热 1h均可存活，但当有双价阳离子存在时，可明显降低禽腺病毒的耐热性，，且，于 60℃条件下加热 1h、80℃加热 10min 或 100 ℃加热 5min 可使该病毒失去活（陈雪妓, 2016）。腺病毒对强酸强碱不耐受，耐受范围在 pH3～9（Gelderblom , 1982），且最适 pH 为 5～6， 该 PH 条件下最适宜病毒复制。此外，在 1: 1000 的醛溶液中不稳定，丙酮也可以使其失去活性。DNA 抑制剂 IuDR 和 BuDR 也可以抑病毒的增殖（Burmester et al., 1960）。大部分的腺病毒具有凝集相应红细胞的能，但不同群的腺病毒根据血清型差异，所能凝集的红细胞种类也不尽相同。I 群禽腺

达到死亡高峰，死亡鸡胚体表潮红、出血、胚体蜷曲较小、甚至出现侏儒胚，剖检可见脾肿大、肺水肿、肝脏斑点状出血及肝细胞内出现核内包涵体（图 2）（Cowen etal., 1988）。I 群禽腺病毒各血清型都能在鸡胚内繁殖存活，但病毒的分离和胚体的病变会因接种方式的不同而不同，有研究表明，采用卵黄囊接种的方式较绒毛尿囊膜更容易分离到病毒（邱丽叶等, 2016）。采用 SPF鸡胚进行病毒分离时通常需要盲传三代以使病毒适应胚体环境，从而进行良好的增殖，有些分离毒株在前三次传代过程中鸡胚的病变不明显，也检测不到病毒的存在，这或许与病毒的增殖方式有关。除了经典的鸡胚增殖分离方法外，还可以利用细胞培养分离病毒，但因禽腺病毒一般不感染异种动物，在异种动物细胞内生存繁殖能力较差，因此培养该病毒最好选用禽源细胞，如雏鸡肾细胞、鸡胚成纤维细胞、原代鸡胚肝细胞等，但成纤维细胞不引起细胞病变。用原代鸡胚肝细胞培养禽腺病毒时，一般 3～4d 内出现遮光性减弱、细胞皱缩变圆成葡萄状、细胞间隙距离增大、最终脱落死亡等特征。富强等研究表明鸡胚肝细胞培养法优于鸡肾细胞培养禽腺病毒。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：2657540