双峰驼CYP2J全长cDNA的克

发布时间：2020-05-10 19:55

【摘要】：CYP2J酶在机体内源性物质和外源性化合物代谢过程中扮演着非常重要的作用,一直是药理学与毒理学的研究重点。本研究的主要目的是克隆双峰驼CYP2J全长cDNA序列,进一步预测该基因完整开放阅读框编码蛋白的结构、性质和功能,并对其编码蛋白进行原核表达。实验首先根据双峰驼CYP2J基因已知的部分片段设计特异性引物,采用RACE技术克隆双峰骆驼CYP2J cDNA 3'和5'序列。通过DNAMAN软件拼接CYP2J cDNA 3'和5'序列的片段,获得双峰驼的CYP2J的全长cDNA序列。随后通过DNAMAN、MEGA 6和ProtParam等多种生物信息学软件分析CYP2J蛋白的结构、性质及进化关系。最后使用pET-21a(+)作为融合表达载体,构建含有CYP2J编码序列的重组质粒pET21a-CYP2J,并诱导其在大肠杆菌BL21中表达。使用SDS-PAGE和Western Blot分析CYP2J蛋白的表达及纯化情况。结果表明,本实验成功获得了双峰驼CYP2J的cDNA的全长。其全长1770 bp,含有8 bp的5'非翻译区(5'-UTR)和253 bp的3'非翻译区(3'-UTR)及1509 bp的完整开发阅读框,共编码502个氨基酸残基。生物信息学分析表明其编码的蛋白质预测分子量为57.98 kD、等电点值为8.45、分子式为C_(2645)H_(4099)N_(713)O_(726)S_(15.)。且该蛋白为稳定的亲水性蛋白质,不具有信号肽,但有一个跨膜区域(12-35aa),主要锚定于内质网,二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成。进一步的系统发育分析显示该蛋白与羊和牛的CYP2J具有最接近的遗传关系,它们都具有一个细胞色素P450家族中共有的血红素结合基序FxxGxRxCxG/A。原核表达结果表明,0.5 mM IPTG在大肠杆菌BL21中37℃诱导6 h后,可实现CYP2J蛋白高效表达。总之,本研究成功获得了双峰驼CYP2J基因cDNA全序列,通过生物信息学分析了ORF的编码蛋白的性质,并进一步表达了其蛋白,为下一步抗体制备以及双峰驼CYP2J蛋白层面的表达分布奠定了基础。
【图文】：

序列,反应机理,细胞色素

存在于绝大多数的细胞色素 P450 中，无论是在其保守。而这一保守序列并不存在于其它类型的蛋白鉴定和区分细胞色素 P450[24-27]；② WXXXR序列，列，它是位于细胞色素 P450 N 端的一段保守序列，TT/S序列，位于细胞色素 P450 的活性中心，在许一序列，其主要与细胞色素与氧分子和或底物分，位于血红素近侧，参与稳定核心结构的作用[28]；因家族保守序列，主要位于细胞色素 P450 的“Me色素 P450 作用机制 P450 酶系可以催化的反应类型多种多样，常被人反应可涉及多个过程。其中，最经典的过程是在 N系统将分子氧还原为水并将一个氧原子加到底物中RH+O2+NADOH+H+ROH+H2O+NADP+

过程图,过程,引物,锚定引物

双峰驼 CYP2J 基因的克隆、生物信息学分析及其原核表达.4.2 RACE 技术原理RACE 技术是利用已知部分 cDNA 序列分别向 3'和 5'端扩增未知的序列，有两分组成，即 3'RACE 和 5'RACE。'RACE：真核生物 mRNA 末端都有一段 poly 尾巴，，以此尾巴设计结合引物 3'-CDSrimer A，随后将目的基因的总 RNA 反转录合成第一链 cDNA。3'RACE 的引物包锚定引物以及特异性引物。锚定引物是试剂盒附带的引物包括 10×Universalrimer A Mix (UPM)和 Universal Primer Short，根据已知序列设计出的基因特异性引 GSP1 和 NGSP1。然后以以合成的 cDNA 为模板，使用引物 10×Universal Primer Aix (UPM)和 GSP2 进行第一轮 PCR 的扩增（图 2）。如琼脂糖凝胶电泳检测无目条带，再利用 Universal Primer Short 和 NGSP2 进行巢式 PCR 扩增，从而得到 3未知序列。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S824

【参考文献】