犬瘟热病毒AS-PCR核酸试纸条的研究

发布时间：2020-05-10 23:11

【摘要】：犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)为副黏病毒科,副黏病毒亚科,麻疹病毒属的成员,为不分节、非重叠单股负链RNA病毒,可引起犬瘟热,侵害免疫系统、血液系统、呼吸系统、消化系统,甚至神经系统,从而导致全身性病理变化。目前对于犬瘟热均采用疫苗免疫的方法进行预防控制,现阶段犬瘟热的预防疫苗主要为弱毒疫苗。但由于弱毒疫苗的大范围推广应用,使疫苗免疫与动物自然感染的区分变得非常困难,所以建立一种可以区分CDV野毒株和弱毒疫苗株的检测方法已势在必行。CDV检测方法有多种,主要包括病毒分离培养、动物接种实验、血清学诊断方法、RT-PCR和实时荧光定量PCR等。其中病毒分离培养和动物接种实验均存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等问题;常规的血清学试验在CDV临床检测上主要的是胶体金免疫层析试纸条,此方法由于操作简单、快速,所以被广泛使用,但同样存在检出率低和难以区分CDV野毒感染和疫苗免疫的不足。而目前能鉴别CDV野毒感染和疫苗免疫的方法为实时荧光定量PCR,此方法对实验仪器的要求较高,并不适合临床检测。因此本课题采用AS-PCR核酸试纸条的方法来区分CDV野毒株和疫苗株。本试验采集武汉地区患犬瘟热的6只病犬的组织样本和临床上广泛使用的2株CDV疫苗株进行全基因组测序,结合已知疫苗株CDV/R-20/8株全基因组序列,对6株野毒株和3株疫苗株的6个蛋白基因从氨基酸水平和碱基水平进行比对分析,发现F蛋白基因和H蛋白基因均有最大10%的差异,同时结合F蛋白和H蛋白2个蛋白在CDV感染过程中的功能,确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。然后对6株野毒株和3株疫苗株进行分型,发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型,而疫苗-1和疫苗-3(CDV/R-20/8株)为American-Ⅰ型,疫苗-2为American-II型,将NCBI上已有的CDV-H基因进行分型,筛出同为Asia-Ⅰ型的CDV-H基因共173株,对179株(6株已测序野毒株+筛出173株Asia-Ⅰ型)的CDV-H基因序列和3株疫苗株H基因序列比对分析,发现野毒株和疫苗株在H基因上有9个较稳定的碱基变异位点,结合引物错配原则设计71对AS-PCR引物;对71对AS-PCR区分引物进行验证实验,找到能够区分CDV野毒株和疫苗株的AS-PCR引物分别是在H基因第469位碱基上G(Asia-Ⅰ型)→A(疫苗株),导致第157位氨基酸上V(Asia-Ⅰ型)→I(疫苗株)的变异位点设计的上游特异引物DI2F-157和H基因较保守区设计的下游通用引物DIR-15R;结合179株Asia-Ⅰ型的CDV-H基因统计碱基差异位点,对引物进行优化,最后确定AS-PCR的上游特异引物:5’-TTAAAATGATTAATGACACTATGTG-3’,AS-PCR的下游通用引物:5’-CCTGGCAAGGCAAGAA-3’,并进行临床验证,临床验证结果显示对临床上已确定的犬瘟热患犬阳性检测达到70%,同时能够区分出野毒株和疫苗株。对AS-PCR的上游特异引物标记生物素,AS-PCR下游通用引物标记FAM,确定链霉亲和素标金的最适pH值和最适浓度,完成链霉亲和素胶体金标记,把AntiFluorescein抗体划线为检测线,生物素化BSA划线为质控线,之后按照核酸试纸条结构进行组装,该核酸试纸条采用双抗夹心法,CDV野毒株阳性样本为检测线和质控线双线显色,CDV疫苗株阴性样本为质控线单线显色。对核酸试纸条进行临床验证,发现该核酸试纸条能够清楚区分CDV野毒株和疫苗株。该方法更简单、快速、准确的检测出犬瘟热自然感染,以消除疫苗免疫在临床上带来的干扰。
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华中农业大学 2019 届硕士研究生学位（毕业）论文—胶体金颗粒)出现显色反应确定试纸条的是否正常，在检测线上形成复合体(抗 B抗体—标记修饰分子 B 的核酸序列/标记修饰分子 A 的核酸序列—抗 A 抗体—胶体金颗粒)确定是否有目的条带 ( Shan et al 2014，Quesada-González et al 2015，，吴刚等 2007，侯巧华 2016)。

图 3.1 2 号犬瘟热病毒全基因组拼接Fig 3.1 Whole genome splicing of canine distemper virus 2
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.655


本文编号：2658043