支气管败血波氏杆菌及其噬菌体的分离鉴定与特性研究

发布时间：2020-05-11 21:42

【摘要】：支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是一种呼吸道病原菌,可广泛感染多种动物引起呼吸道疾病,尤其是在动物免疫力较低的情况下,容易与其它病原形成混合感染,导致更为严重的疾病。对养猪业而言,Bb单独感染主要引起猪支气管肺炎或非进行性萎缩性鼻炎(Non-progressive atrophic rhinitis,NPAR),与产毒素多杀性巴氏杆菌共感染可引起进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis,PAR),降低猪只饲料转化率,使得猪只生长缓慢,造成严重的经济损失。噬菌体(Bacteriophage)是一类特异性感染细菌的病毒。根据噬菌体的寄生方式可将噬菌体分为裂解性噬菌体与溶原性噬菌体。裂解性噬菌体主要用于临床防治多重耐药菌的感染,因溶原性噬菌体具有整合到宿主菌的特性,可改变宿主菌的一些性状,故不用于致病菌的防治。本研究旨在从我国规模化猪场中分离支气管败血波氏杆菌并对其进行药物敏感性分析,了解Bb近两年的耐药情况,为指导临床用药奠定基础。并选用临床分离的Bb作为指示菌进行相关噬菌体的分离鉴定,为进一步研究支气管败血波氏杆菌噬菌体奠定基础。主要研究内容如下:1.猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定在2016~2018年期间,从我国广东、贵州、四川、河南、湖北、福建、河北、江西、山西、内蒙古、湖南等地的1735份病死猪肺脏组织中共分离到119株Bb,分离率为6.86%。将临床分离菌株进行药物敏感性测定,结果显示Bb对磺胺甲恶唑、甲氧苄啶敏感性低,对庆大霉素、红霉素、氧氟沙星、多粘菌素B敏感性较高;耐药基因以sul2检出率较高,同时检测到目前国外未报道的sul3基因。2.支气管败血波氏杆菌噬菌体PHB09的生物学分析采用传统的双层平板法,从湖北省某猪场污水中分离到三株支气管败血波氏杆菌噬菌体,将其中一株以Bb01为指示菌分离到的噬菌体命名为vB_BbrS_PHB09。PHB09在平板上形成形状不规则、浑浊的噬菌斑。经电镜观察确定PHB09有一正多面体的头部,约62.8±1.5 nm,以及一个长的不收缩的尾部,长约177.7±2.3 nm,宽约7.6±2.5 nm。由此可知,PHB09属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。PHB09能裂解89株Bb(n=119),而不能裂解其它种属的细菌,如荚膜A型和D型多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌DH5α。将PHB09进行全基因组测序分析,结果表明,PHB09基因组为双链线性DNA,基因组长度大小42,129 bp,G+C含量62.8%。预测到PHB09共59个编码区(CDS),其中25个CDS为功能性蛋白,其它34个CDS为未知蛋白。通过tRNAscan-SE预测到一个tRNA-Met-CAT。另外预测到PHB09含有一个整合酶基因及溶原模块。通过噬菌体末端大亚基进化树分析可知,PHB09处于一个独立的分支,为一株新型噬菌体。3.整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01的表型特征分析通过测序可知,PHB09为溶原性噬菌体,根据PHB09的溶原特性,筛选出一株整合PHB09基因组的细菌,命名Bb01+,将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01进行基因组测序比对分析,找到PHB09唯一的一个整合位点。将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01分别测定一步生长曲线,发现两者在体外培养无明显差异,表明PHB09整合到宿主菌后不影响宿主菌的生长。将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01稀释到0.5麦氏比浊浓度进行药物敏感性测定,发现两者的MIC结果无显著差异,且未预测到PHB09携带耐药基因,表明PHB09整合到宿主菌后不改变宿主菌的耐药性。4.整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01的致病性研究将菌株进行血清抗性试验检测。整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01与小鼠血清分别于37℃作用1 h、2 h。结果表明,整合菌株Bb01+对血清的敏感性高于亲本菌株Bb01对血清的敏感性,说明整合菌株Bb01+更容易被血清清除。使用鼠源巨噬细胞(RAW264.7)以10:1(细菌:细胞)进行细胞吞噬试验。在相同作用时间下,整合菌株Bb01+对吞噬细胞的抗吞噬能力低于亲本菌株Bb01。表明整合菌株Bb01+更容易被吞噬细胞吞噬。使用人喉癌上皮细胞(Hep-2)以100:1(细菌:细胞)进行细胞黏附与侵入试验。与亲本菌株Bb01相比,整合菌株Bb01+的黏附能力和侵入能力都降低,表明PHB09整合到宿主菌后降低了宿主菌的黏附与侵入能力。将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01分别以10~7、10~8 CFU剂量滴鼻接种5周龄BALB/c小鼠,记录死亡情况并计算MLD。结果显示,2×MLD剂量的整合菌株Bb01+对小鼠不致死。说明PHB09整合到宿主菌后大大降低了宿主菌的致病性。
【图文】：

图 4-3 猪源 Bb 的 PCR 鉴定Fig. 4-3 PCR identification of BbL2000 DNA Marker 1-7: PCR identifica8: Positive control 9: Negative contr

图 4-1. 支气管败血波氏杆分离省份Fig.4-1 The provicen of isolated Bb strains图 4-2 Bb 在 TSA+血清平板上的生长Fig.4-2 The growth of Bb on the TSAserum agar
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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本文编号：2659111