犬冠状病毒的分离鉴定及两种检测方法的建立

发布时间：2020-05-15 18:49

【摘要】：犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCoV)是小肠的自限性病原体,一般会导致幼龄犬非致死性的轻度腹泻,当与其他肠道病原体共感染时,患病动物死亡率升高。1971年CCoV首次在德国报道,目前呈世界性流行。近年来,随着欧洲地区多例致死性的CCoV高致病性变异毒株的报道,引起全球研究学者的普遍关注。本试验旨在对从北京地区采集到的犬粪便样品进行检测,并对部分阳性样品进行病毒分离,经鉴定确实为CCoV,之后用分离的病毒建立用于CCoV检测的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法和鉴别CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的双重纳米RT-PCR方法,以期可以深入了解北京地区CCoV的流行情况,为犬冠状病毒病的诊断、防治及后续相关研究奠定基础。用优化后的RT-PCR法对采集于北京地区犬粪便样本进行犬冠状病毒检测及基因型鉴定,从检测的阳性样本中筛选出病毒粒子浓度高且无其他犬常见病毒感染的3个样品进行CCoV的分离。2份样品在增殖至4代前CPE明显,通过RT-PCR法显示为阳性,至第5、6代CPE不明显甚至消失,RT-PCR法结果显示为阴性,另外1份样品成功分离,说明CCoV在细胞上能出现CPE,但是病毒增殖较不稳定。应用参考毒株的多抗对分离毒进行了间接免疫荧光试验,并结合形态学鉴定,确定该病毒为CCoV,经RT-PCR法鉴定其基因型为Ⅱ型。对CCoV分离株C-末端9 kb的基因片段进行克隆并测序,通过与Gen Bank中提供的其他CCoV基因组比对,结果显示与CCoVfc1株有最高同源性,属于CCoVⅡ型的分支中,与国内的分离株同源性也很高,说明国内CCo V在进化上很可能存在共同的来源,与CCo V-Ⅰ型的23/03株同源性最低,之后在NCBI中进行BLAST发现与意大利的CCoV strain 430/07株同源性最高,高达约96%。应用分离的病毒建立了快速检测CCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,最低能检测出45copies,应用该方法对采集北京地区的某犬养殖场和动物医院共计76份粪便样品进行检测,结果揭示,集约型养殖很容易导致整个犬群CCoV的传播流行。同时建立了用于鉴别CCoV-Ⅰ和CCo V-Ⅱ的双重纳米RT-PCR方法,具有良好的特异性和灵敏性,并且操作简便快捷,灵敏性试验表明最低核酸检测量是普通RT-PCR方法的100倍。用双重纳米RT-PCR方法对采集于北京地区的60份粪便样本进行检测,结果可知CCoV-Ⅱ型在犬群中的感染率较大,相比较CCoV-Ⅰ而言占优势,并且结果显示犬群中存在两种基因型共感染的情况。
【图文】：

结构模式,结构基因组,正股,多顺反子

结构基因组是一段连续的单链正股 RNA，是一个多顺反子，大小A 病毒中基因组最大的（Lai et al., 1997）。CCoV 基因组 RNA 构（cap）和多聚 A 尾，从 5' 端到 3' 端包含 10 个开放性阅读框ose et al., 2012）。5'端为两个重叠的开放阅读框 ORF1a（12354病毒复制和转录有关的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶和蛋白酶，其 1/3，从 5' ~3' 端依次为 S（4362 bp），ORF3a（213 bp），ORFE（246 bp），M（798 bp），N（1203 bp），ORF7a（303bp）关振宏，，2004; Decaro N et al., 2015）。其中 ORF3a、ORF3b 和 S 相邻，其余各 ORF 间由内含子分隔开。图 1.1 CCoV 的结构模式图（王欣宇, 2017）Fig. 1.1 The model diagram of CCoV (Wang Xinyu, 2017)

示意图,基因组结构,示意图

1.1.4 基因组结构CCoV 的基因组是一段连续的单链正股 RNA，是一个多顺反子，大小在 27~32Kb 之间，是目前所有 RNA 病毒中基因组最大的（Lai et al., 1997）。CCoV 基因组 RNA 的 5’端和 3’端分别为典型的帽子结构（cap）和多聚 A 尾，从 5' 端到 3' 端包含 10 个开放性阅读框架（ORF）（Horsburghet al., 2012; Jose et al., 2012）。5'端为两个重叠的开放阅读框 ORF1a（12354 bp）和 ORF1b（8037bp），编码与病毒复制和转录有关的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶和蛋白酶，其余 8 个 ORF 占整个基因组序列的 1/3，从 5' ~3' 端依次为 S（4362 bp），ORF3a（213 bp），ORF3b（735 bp），ORF3c（238 bp），E（246 bp），M（798 bp），N（1203 bp），ORF7a（303bp），ORF7b（639 bp）（图 1.2）（关振宏，2004; Decaro N et al., 2015）。其中 ORF3a、ORF3b 和 ORF3c 中存在交叉重叠，ORF1b 与 S 相邻，其余各 ORF 间由内含子分隔开。图 1.1 CCoV 的结构模式图（王欣宇, 2017）Fig. 1.1 The model diagram of CCoV (Wang Xinyu, 2017)
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】