uPA与uPAR调节体外培养牛卵丘颗粒细胞增殖的机制研究
发布时间：2020-05-17 04:39
【摘要】：本实验室前期研究发现,uPA与锚定于自身细胞膜外的uPAR结合,进而促进细胞的增殖。为了深入了解uPA与uPAR调节体外培养牛卵丘颗粒细胞增殖的具体机制,本研究综合细胞培养、细胞增殖、Western bot、ELISA等多种技术,探讨了uPA、uPAR、cAMP和磷酸化ERK与AKT表达在牛卵丘颗粒细胞增殖过程中可能的互作机制。研究结果显示,(1)0.5ng/mL uPA分别作用不同时间2、5、10、20、30min后,5 min处理组显示最高的ERK与AKT磷酸化水平,均极显著高于对照组(P0.01);联合添加0.5 ng/mL uPA与1μg/mL Amiloride处理5 min后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+Amiloride)中磷酸化ERK与AKT表达量极显著降低(P0.01),说明Amiloride能够明显抑制uPA对牛卵丘颗粒细胞中磷酸化ERK与AKT表达的促进作用。(2)联合添加0.5 ng/mL uPA与10μL/mLuPAR抗体继续培养5 min后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+uPAR抗体)的磷酸化ERK与AKT极显著降低(P0.01),说明uPA与其受体uPAR结合后,能够激活ERK与AKT信号。(3)联合添加uPA与Amiloride或者uPA与uPAR抗体分别培养5 min后,与对照组比较,添加uPA组能显著上调cAMP水平(P0.01);与uPA组相比,联合添加组(uPA+Amiloride或uPA+uPAR抗体)极显著下调了cAMP水平(P0.01),说明Amiloride能够抵消uPA对卵丘颗粒细胞内cAMP水平的提升作用,而此过程与uPAR相关。(4)联合添加0.5μM Rp-cAMP与uPA培养5 min后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+Rp-cAMP)的磷酸化ERK与AKT表达量极显著降低(P0.01),说明uPA通过上调cAMP水平,刺激PKA信号通路,进而激活下游ERK与AKT磷酸化过程。(5)联合添加Rp-cAMP与uPA培养48 h后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+Rp-cAMP)中卵丘颗粒细胞数量极显著降低(P0.01),说明Rp-cAMP能够抵消uPA对卵丘颗粒细胞增殖的诱导作用。综上所述,本研究揭示了uPA与uPAR调节牛卵丘颗粒细胞增殖的信号机制:uPA结合卵丘颗粒细胞膜上受体uPAR,上调细胞内cAMP水平,激活PKA通路,使下游ERK与AKT被磷酸化,最终促进体外培养的牛卵丘颗粒细胞增殖。本研究结果对于深入理解牛卵泡发育调控机制,具有重要意义。
【图文】：
果与分析的培养及生长状态接接种贴壁的方法进行培养牛卵丘颗粒细胞。原代培养牛卵丘颗 1×105个/mL 进行接种到 25 cm2培养瓶中，，12-24 h 后观察到细胞形变成长梭形，向两头伸展成长梭形；2-3 d 后，细胞逐渐呈长条开始汇合。4 d 后卵丘颗粒细胞大量贴壁生长，部分细胞变成多长满瓶底，基本汇合成单层，细胞基本呈现不规则的多边形，之细胞培养过程中汇合达到 80%左右，即可进行传代培养。传代培血清的 DMED 中生长旺盛，6 h 即可见到细胞贴壁。在早期(1现出长梭形，偶尔也会出现多边形(见图 1)。
图 2 添加 uPA 处理不同时间后对培养牛卵丘颗粒细胞中 ERK1/2 磷酸化表达的影响ERK1/2 和 p-ERK1/2 荧光条带(A)，p-ERK/ERK 荧光分析值（B）。“**”代表差异极显著（P<0.01）。Fig.2 Effect of uPA with different treating periods of 0, 2, 5 10,20 and30 mins on ERK1/2 phosphorylatioof bovine cumulus granulosa cells cultured. Immunoreactive bands corresponding to active ERK1/2 andp-ERK1/2is indicated as A , p-ERK/ERK value as B.“**”presents the significant difference (P<0.01).
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
本文编号：2667952
【图文】：
果与分析的培养及生长状态接接种贴壁的方法进行培养牛卵丘颗粒细胞。原代培养牛卵丘颗 1×105个/mL 进行接种到 25 cm2培养瓶中，，12-24 h 后观察到细胞形变成长梭形，向两头伸展成长梭形；2-3 d 后，细胞逐渐呈长条开始汇合。4 d 后卵丘颗粒细胞大量贴壁生长，部分细胞变成多长满瓶底，基本汇合成单层，细胞基本呈现不规则的多边形，之细胞培养过程中汇合达到 80%左右，即可进行传代培养。传代培血清的 DMED 中生长旺盛，6 h 即可见到细胞贴壁。在早期(1现出长梭形，偶尔也会出现多边形(见图 1)。
图 2 添加 uPA 处理不同时间后对培养牛卵丘颗粒细胞中 ERK1/2 磷酸化表达的影响ERK1/2 和 p-ERK1/2 荧光条带(A)，p-ERK/ERK 荧光分析值（B）。“**”代表差异极显著（P<0.01）。Fig.2 Effect of uPA with different treating periods of 0, 2, 5 10,20 and30 mins on ERK1/2 phosphorylatioof bovine cumulus granulosa cells cultured. Immunoreactive bands corresponding to active ERK1/2 andp-ERK1/2is indicated as A , p-ERK/ERK value as B.“**”presents the significant difference (P<0.01).
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【参考文献】
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本文编号：2667952
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