奶牛乳腺炎相关lncRNA的鉴定和功能验证

发布时间：2020-05-18 07:08

【摘要】：奶牛乳腺炎通常由致病菌侵入奶牛乳腺后并在乳房增殖引起的一种疾病,是奶牛养殖业最流行的疾病之一,给全球造成了巨大的经济损失。而环境中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被认为是奶牛乳腺炎的主要致病菌。大肠杆菌的主要结构元件脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和金黄色葡萄球菌胞壁成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)可通过结合Toll样受体引起NF-κB转录因子复合体的激活参与炎症反应过程。越来越多的研究表明长非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)也在炎症反应中发挥着重要的作用,然而参与牛乳腺炎中lncRNA及其功能仍然未知。本实验中使用热灭活的细菌处理奶牛乳腺上皮细MAC-T细胞,以肿瘤坏死因子-α明显上调作为炎性应答指标,建立乳腺炎细胞模型,并通过高通量测序分析获得了正常MAC-T细胞和乳腺炎模型细胞的lncRNA表达谱,然后运用生物信息学方法筛选出差异表达的lncRNA,最后结合CRISPR-Cas9系统进一步研究特定候选lncRNA的功能。测序结果中共鉴定出1323个新的lncRNA,其中53个为差异表达的lncRNA。而lncRNA的功能预测表明差异表达的lncRNA与细胞免疫密切相关。对新发现的被命名为lncRNA-TUB的lncRNA进行深入功能研究发现,敲除lncRNA-TUB后,乳腺上皮细胞发生了明显的EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)现象,同时影响上皮细胞增殖、迁移、酪蛋白分泌等生理过程,并参与乳腺上皮细胞的炎症应答过程。综上所述,实验结果表明本研究筛选出的差异表达的lncRNA与奶牛乳腺炎紧密相关,而lncRNA-TUB在包括炎症应答在内的很多重要的生理和病理过程中发挥着重要的作用。本研究初步探索了lncRNAs与奶牛乳腺炎之间的相互联系,为奶牛乳腺炎的病理机制的研究提供了新的思路。
【图文】：

中序,文库,基因组,非编码

图 1 六个文库中序列的参考基因组比对率Fig. 1 The number of filtered reads obtained in each biological replicates of Con, EC andSA samples and the percentage of aligned sequences to the bovine reference genome. The blueand the pink color represent the percentage of unmapped and mapped sequence reads respectively.Rep-1 and Rep-2 are the biological replicates in each sample.2.5.2 鉴定预测的 lncRNA为了减少假阳性 lncRNA 和假阴性 lncRNA 结果出现的可能性，我们建立了严谨的筛选流程（图 2）。作为 lncRNA 鉴定的关键环节，使用 CPC 和 CNCI 软件同时对转录本进行编码潜力分析。CPC 鉴定出 1448 个预测的非编码转录本，CNCI 鉴定出 2588 个预测的非编码转录本。取两个软件鉴定出的共同的序列集（包含 1323 个非编码序列）作为预测的 lncRNA。所有鉴定出的 lncRNAs 通过Cufflinks 区分为 5 类：基因间 lncRNA，内含子 lncRNA，反义 lncRNA，正义 lncRNA和双向 lncRNA。

差异表达,处理组,金黄色葡萄球菌

这些实验组中上调的 mRNA 数量也多过下调的 mRNA 数量（图3）。更值得注意的是，差异表达的 mRNA 和 lncRNA 的聚类分析显示金黄色葡萄球菌处理组与对照组聚为了一类，而大肠杆菌处理组却反而没能与金黄色葡萄球菌处理组聚类(图 4)。另外，还发现一些差异表达的 lncRNA 和 mRNA 在其他实验组中也有表达。这些证据表明，差异表达的 lncRNAs 可能为细菌特异性乳腺炎导致不同临床症状的表观遗传学原因。图 3 差异表达的 mRNA 和 lncRNA 的比较(A)和(B)分别为表达上调下调的 mRNA 和 lncRNA 的数目。(C)和(D)分别为差异表达的 mRNA 和 lncRNA 在 CON vs EC 组，CON vs SA 和 EC vsSA 组中的分布。Fig.3 Comparison of differentially expressed lncRNA and mRNA. (A) and (B) Numbers ofup-regulated and down-regulated mRNAs and lncRNAs were calculated in CON vs EC group,CON vs SA group and EC vs SA group. (C) and (D) Venn diagram showed the differentiallyexpressed mRNAs and lncRNAs in CON vs EC group, CON vs SA group
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

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