约氏乳酸杆菌对鸡骨髓源树突状细胞成熟的影响

发布时间：2020-05-18 12:18

【摘要】：树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是机体内功能最强大的专职抗原呈递细胞(Antigen presenting cell,APC),也是目前发现唯一能直接激活初始型T细胞的APC。DCs广泛存在于胃肠道中,是肠道黏膜免疫系统主要的守卫者,在调节黏膜免疫应答及免疫耐受中扮演着重要角色。近年来研究发现,多种微生物能影响DCs的分化和成熟,包括肠道乳酸菌。乳酸菌具有免疫调节作用,可以调节多种免疫细胞如DCs和NK,促进其生长和发育。本研究以鸡肠道约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii,L.johnsonii)为研究对象,研究其对鸡骨髓源树突状细胞(Chicken bone marrow-derived dendritic cells,ChBM-DCs)的影响。主要从DCs的形态、细胞表面分子表达情况、吞噬能力、混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR),Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)、MyD88/NF-κB信号通路分子和细胞因子基因转录水平等方面进行评价。具体研究内容和结果如下:为获得chBM-DCs,我们选取4-6周龄SPF鸡,取其股骨和胫骨,利用Histopaque-1119淋巴细胞分离液分离得到鸡骨髓源单核细胞,平铺6孔板,加入rcGM-CSF和rcIL-4细胞因子,置于39℃、5%CO_2培养箱中诱导培养。诱导培养4 d时,经倒置显微镜观察可看见大量细胞集落形成,培养至6 d时,细胞集落松散贴壁,获得了未成熟的chBM-DCs。将培养至6d的细胞分成3组:阴性对照组,加入相等量的基础RPMI-1640;阳性对照组,加入终质量浓度为200 ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS);试验组,加入经紫外灭活浓度为100μg/mL的L.johnsonii,继续培养24 h。结果显示:通过流式细胞术检测诱导培养1 d和7 d的鸡骨髓源单核细胞细胞表面分子表达,结果显示:第1 d时,细胞表面不表达CD11c和MHC-II分子;第7 d,未刺激组、LPS刺激组和L.johnsonii刺激组细胞表面高表达CD11c,纯度达70%以上;未刺激组chBM-DCs低表达CD40和CD86,细胞处于未成熟状态,而LPS刺激组和L.johnsonii刺激组,CD40和CD86表达量上调,细胞被刺激成熟。经RT-qPCR检测chBM-DCs中CD80、CD86和DEC-205 mRNA转录水平,结果发现,与未刺激组相比,LPS刺激组和L.johnsonii刺激组CD80、CD83和DEC-205的mRNA表达量上调,其中CD83的mRNA水平差异极显著(P0.01)。收集诱导培养2 d、4 d、6 d和7 d未经刺激的细胞以及经LPS和L.johnsonii刺激24 h的chBM-DCs,采用中性红检测其吞噬能力,结果显示,鸡骨髓单核细胞经rcGM-CSF和rcIL-4诱导培养2 d、4 d、6 d和7 d后,吞噬能力先增强后降低,第6 d时吞噬能力达到最大;与未刺激的chBM-DCs相比,经LPS和L.johnsonii刺激的chBM-DCs吞噬能力降低,但差异不显著(P0.05)。以未成熟的chBM-DCs以及经LPS(200 ng/mL)和L.johnsonii(100μg/mL)刺激成熟的chBM-DCs为刺激细胞,同种异体T淋巴细胞为反应细胞,分别按刺激细胞:反应细胞为1:1、1:10、1:100的比例进行混合,采用CCK-8试剂盒检测T细胞的增殖能力。结果显示,经LPS和L.johnsonii刺激成熟的chBM-DCs均能够诱导T细胞增殖,与对照组相比差异极显著(P0.01),刺激指数随着细胞数的减少而降低。采用LPS和L.johnsonii刺激chBM-DCs,分别于刺激后6 h、12 h和24 h收集细胞,以未经刺激的chBM-DCs作为对照,通过RT-qPCR方法检测TLR2/4/5/15和MyD88/NF-κB信号通路分子等mRNA的转录水平,以观察不同刺激时间L.johnsonii对chBM-DCs的影响。结果显示,与对照组相比,L.johnsonii在各时间段都能够促进TLR2、TLR4和TLR5 mRNA表达量增加(fold change1),特别是TLR5,而TLR15 mRNA的表达量下降(fold change1);与LPS组相比,TLR2在L.johnsonii刺激6 h和12 h后mRNA的表达量分别差异极显著(P0.01)和差异显著(P0.05),TLR4在L.johnsonii刺激6 h后mRNA的表达量差异显著(P0.05),而TLR5在各时间段mRNA的表达量均差异极显著(P0.01)。在LPS组和L.johnsonii组,TLR15的mRNA表达量均低于未刺激组(fold change1)。同时,L.johnsonii在各时间段都能够促进MyD88/NF-κB信号通路mRNA表达量增加(fold change1)。采用不同浓度的L.johnsonii(1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL)刺激chBM-DCs,于刺激后6 h、12 h和24 h收集细胞,通过RT-qPCR方法检测Th1型和Th2细胞因子、促炎性细胞因子和趋化因子基因的转录水平,以分析L.johnsonii不同浓度和不同刺激时间对上述细胞因子的影响。结果显示,与未刺激组相比,在各个时间段低浓度L.johnsonii(1μg/mL)刺激的chBM-DCs细胞因子和趋化因子(CXCLi1)mRNA相对表达量均降低(fold change1);中高浓度的L.johnsonii(10μg/mL和100μg/mL)刺激chBM-DCs后,在各个时间段Th1型细胞因子、促炎性细胞因子和趋化因子mRNA相对表达量均高于未刺激组(fold change1),而仅高浓度L.johnsonii(100μg/mL)组才能够促进Th2型细胞因子mRNA相对表达量增加(fold change1),LPS组在各个时间段均不能促进Th2型细胞因子(IL-4)mRNA相对表达量增加(fold change1)。高浓度L.johnsonii组在各个时间段IL-12、IFN-γ、IL-1β和IL-6mRNA相对表达量均高于LPS组(P0.01)。此外,Th1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α)以及促炎性细胞因子和趋化因子mRNA的表达量随着刺激时间的增加而降低,而Th2型细胞因子随着刺激时间的增加而增加。以上结果表明,L.johnsonii能够刺激chBM-DCs成熟,并且以剂量依懒性和时间依赖性方式影响chBM-DCs细胞因子和趋化因子的产生,同时可以调节Th1/Th2平衡,维持机体稳态。
【图文】：

信号转导途径

表达是诱导 DCs 分化成熟的基础，影响着其功能的发挥[44]。TLRs间的关系己成为免疫学等研究疾病发病机制的热点[45]。TLRs 是一类，其胞外有亮氨酸重复序列结构可以识别病原微生物。现，不同的 TLRs 活化后的信号通路也不相同。髓样ifferentiationfactor88，MyD88）、TRIF 以及 TRIF 相关的接头分子是白分子[46]，其中 MyD88 是 TLRs 在胞浆内重要的接头蛋白分子，主要依赖途径和非 MyD88 依赖途径[47]。其中大多数 TLRs 的信号传导途这种途径与成熟 DCs 释放炎症细胞因子有关。DCs 表面的 TLRs 可以二者结合后结构发生改变，随后再与 MyD88 结合，又导致其本身发离，将信号传递给下游分子，，经过一系列蛋白质级联信号反应，最终46]。NF-κB 信号通路的激活上调了 DCs 表面共刺激分子和 MHC-II 的放大量的细胞因子，激活初始型 T 淋巴细胞，促进 T 细胞增殖分化，-Nhoum 等已证实 TLRs 可以与肠道内的益生菌的 MAMP 发生特异性信号通路来维持肠道稳态[48]。Galdeano 等研究表明，乳酸杆菌的微icrobe asso-dated molecular patterns，MAMP）通过与 DCs 表面的 T NF-κB 信号途径刺激免疫细胞产生免疫效应分子，启动天然免疫和获

乳酸菌,细胞的,相互作用,细胞因子

图 1-2 益生乳酸菌与树突状细胞的相互作用[62]Fig. 1-2 Interaction of the probiotic lactobacillus with dendritic cells因子在免疫过程中的作用子（Cytokine）是一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，主要是疫细胞经刺激而合成分泌的，可广泛调控机体免疫应答和造血功能，过程。细胞因子种类繁多，功能十分复杂，按照生物学功能分类主要刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、趋化性因子以及生长因子等。细个阶段都起着十分重要的作用，被认为是免疫反应中的决定性因子，的活化、增殖与分化，决定其分化的方向[65, 66]。初始 T 细胞被抗原激Th0 细胞可化为 Th1 和 Th2 细胞，局部微环境中的细胞因子种类是决因素。IL-12 可促进 Th1 细胞的分化，IL-4 可促进 Th2 细胞的分化生不同的细胞因子，在免疫应答中发挥重要作用。Th1 细胞可以分泌细胞因子，参与炎症反应，同时也能够激活固有免疫应答；Th2 细胞可细胞因子，参与抗病虫感染，促进 B 细胞的活化、增殖与分化。Th1 细胞疫应答，并且抑制 Th2 细胞功能；Th2 细胞分泌 IL-10，抑制 Th1 细
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831

【参考文献】