驴微卫星13重PCR体系的构建与应用

发布时间：2020-05-19 06:17

【摘要】：微卫星是分析种群遗传多样性、鉴别亲子关系最主要的DNA分子标记。驴的品种种类繁多,利用微卫星研究驴群的遗传多样性、确定子代与父本间的亲缘关系,可以帮助我们对其进行遗传资源保护或人工选育。在以往的研究中,人们利用马的微卫星荧光多重PCR体系研究驴的群体结构或鉴定驴的亲缘关系,由于用于鉴定的微卫星位点不合适、引物特异性差以及扩增效率低,常存在基因分型困难的问题。2017年,国际动物遗传学协会(ISAG)推荐13个双核苷酸微卫星位点(AHT4、ASB23、HMS2、HMS3、HMS6、HMS7、HMS18、HTG7、HTG10、TKY297、TKY312、TKY337和TKY343),用于驴的个体识别和亲子鉴定研究。到目前为止,还没有研究构建出一组包含这13个核心位点的多重PCR体系。本研究通过重新设计部分微卫星位点的引物、反复试验优化多重PCR的反应体系和反应条件,构建一组驴的微卫星13重PCR体系,包含ISAG推荐的13个微卫星位点。(1)本研究使用低成本的扩增酶可以高效地在一个PCR反应中扩增全部的微卫星位点,优化后的PCR反应体系缩减为15μL、PCR反应时间缩短为73 min。荧光标记引物的应用使扩增产物的测序变得快速、简单。(2)本研究检测了该多重PCR体系的灵敏度,仅使用5 ng的驴样本DNA为模板,便可获得完整准确的基因分型图谱。(3)通过检测该多重PCR体系的物种特异性,发现以13个物种的基因组DNA为模板无法得到完整的基因分型图谱。(4)本研究提供了首个驴的等位基因分型表和Stutter分析结果,有助于研究人员揭示准确的基因型。(5)以150头驴为样本,计算群体统计学参数,分析发现多数位点的杂合度与多态信息含量很高,该多重PCR体系的CPE_(trio)可达到0.999665018,表明该多重PCR体系具有研究驴的遗传多样性及鉴定亲子关系的能力。试验结果表明,本研究开发的微卫星13重PCR体系,是一种快速、高效、灵敏度高、物种特异性好、准确可靠的检测手段,适用于驴的群体遗传分析、个体识别以及亲子鉴定,同时具有法医应用潜力。
【图文】：

示意图,体系构建,微卫星,多重PCR

检测新设计引物的特异性，确保 PCR 扩增产物条带单一明亮。预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，Tm ±3 ℃ 30 s，72 ℃延伸 30 s，5 min。 13 重 PCR 体系的构建与优化星 13 重 PCR 体系的构建用 AHT4、ASB23、HMS2、HMS3 和 HMS6 位点的引物构建 5 重初始浓度和 PCR 反应条件参考 Shang 等（2018）的研究报告。 PCR 体系的引物浓度和退火温度，，以产物的目的条带清晰且扩使用 4 %的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。接着在 5 重 PC位点的引物，利用多重PCR扩增方法和琼脂糖凝胶电泳结果对体重 PCR 体系。以此类推，不断加入新的引物并通过反复试验进出 13 重 PCR 体系。微卫星 13 重 PCR 体系的构建方法如图 2-1

重复单位,杂合,分型,滑脱

模板进行扩增，不同物种的 DNA 样本加入量为 30-50 ng。使用产物送至上海生工测序部进行 CE 测序。析聚合酶滑脱产物分析 PCR 扩增微卫星位点序列时，往往会在 DNA 复制的过程中发生聚合酶滑脱产物（Stutter）的产生，这在分析双核苷酸微卫星的Shang et al.，2018）。在 PCR 扩增过程中，当碱基发生正向滑脱产物少一个重复单位的 PCR 产物（minus Stutter），当碱基发生要扩增产物多一个重复单位的 PCR 产物（plus Stutter），如图 us Stutter 的峰值占主要扩增产物峰值的比值和 plus Stutter 的峰值比值，可以指导实验人员选择正确的基因型（Shang et al.，2018
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S822

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