猪瘟疫苗C株WH303表位突变毒株的构建及在细胞和兔体中特性研究

发布时间：2020-05-19 14:01

【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)所引发的一种急性、热性和致死性传染病。猪瘟标记疫苗(Marker Vaccine)具有区别猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体的特点,可以用于净化及紧急免疫。近年来,陆续有国内外研究者应用分子生物学和基因工程方法,对猪瘟野毒或弱毒进行基因修饰构建出新毒株,其中以Erns和E2为基础构建新毒株的方法在猪瘟标记疫苗的研究中占据着重要地位。WH303单克隆抗体表位为线性表位,位于猪瘟的E2蛋白,突变后不能与相应的单克隆抗体反应,猪瘟C株为我国研发的具有良好安全性和免疫保护效果的疫苗毒株。故本研究在猪瘟兔化弱毒C株的基础上突变WH303表位构建猪瘟标记疫苗候选毒株。本研究通过自行设计引物IVDC582、IVDC583,运用重叠PCR的方法,扩增出了包含WH303最小识别序列在内的2047bp大小的片段;然后将该片段连接至T载体,得到MT-582583;再以限制酶SnaBI和NgoMIV酶切连接至实验室构建的质粒pMD18-T-NotI-BamHI和pMD18-T-NotIBamHI-flag;最后用限制酶NotI和BamHI酶切连接至C株和C-flag株的感染性克隆,从而完成突变毒株MC与MC-flag的感染性克隆构建。经体外转录成病毒RNA,利用电转的方法将MC株电转至PK15细胞,连续传代,使用单抗WH303和1C8对病毒液进行免疫组化染色,以确定MC株是否成功拯救。兔体接种C株和MC株,观测兔子体温变化情况。体温达到峰值时,对兔进行安乐死,取脾脏和其他主要器官,进行RT-PCR检测和测序,同时制备组织切片,通过免疫组化来确定MC株在兔体的增殖情况。在3d、7d、14d和21d四个时间段取兔全血,制备血清,进行酶联免疫吸附试验(ELISA),检测血清中抗体含量。通过重叠PCR的操作方法,成功筛选出M-297300阳性克隆;将M-297300连接至T载体得到MT-582583;通过酶切连接操作,成功构建出了pMD18-T-NotI-BamHI-582583M和pMD18-TNotI-BamHI-flag-582583M阳性质粒;再次酶切连接,最终构建成功了MC和MC-flag感染性克隆并拯救出了病毒株。在病毒MC传代的过程中免疫组化结果显示,在48h后、第六代和第十二代以单抗1C8进行免疫组化染色均为阳性,WH303染色为阴性,表明病毒成功拯救并稳定传代。MC株在兔体内传三代,MC接种兔体结果显示,在前两代中兔体发热情况不明显,第三代基本呈定型热反应。RT-PCR结果显示在第一代4只兔子中,只有一只出现目的条带,第二代和第三代全部出现目的条带,且测序结果均显示与引物IVDC582、IVDC583一致,说明在兔体传代的过程中突变毒株MC保持基因稳定。组织切片免疫组化染色的结果显示MC在脾脏和淋巴结内含量明显高于其他组织。接种MC株的兔血清阻断ELISA抗体检测结果为阴性,说明血清中没有特异性识别WH303位点的抗体;间接ELISA抗体检测结果为阳性,说明血清中存在猪瘟特异性抗体。本研究在C株的基础上突变WH303位点,在一定程度上避免了由强毒回复突变造成的生物安全隐患,而且突变毒株可以保持兔化弱毒C株的基本特性。再辅以后续研究的鉴别诊断方法,有望成为猪瘟标记疫苗。
【图文】：

路线图,构建技术,分子生物学,路线图

flag-582583M 和 pMD18-T-NotI-BamHI-582583M，分别连接至 C-flag 株全长和 C 株全长，通过PCR 和酶切验证的方法最终分别筛选出 csfull-flag-582583M 和 csfull-582583M 阳性克隆即 MC-flag 和 MC 感染性克隆。1.5.2 突变毒株的拯救和细胞传代将 MC 感染性克隆以限制酶 SwaI 线性化，体外转录成 RNA，去除 RNA 酶后，用电转的方法转染至 PK15 细胞，并连续传代，通过过免疫氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和间接免疫荧光染色的方法鉴定是否成功将突变感染性克隆的 RNA 导入 PK15 细胞并复制出病毒。1.5.3 MC 株在兔体中的传代及免疫抗体检测主要进行兔体实验。将培养的细胞突变毒 MC 株与 C 株进行兔体接种，然后观测兔体温变化，待兔体温上升至峰值时对兔安乐死，采取心、肝、脾、肺、肾和下颌淋巴结等组织，，制备组织切片并保存脾毒。分别用单抗 WH303 和 1C8 对脾脏组织切片进行免疫组化染色，通过染色结果进一步确定 MC 株是否成功完成 WH303 位点的突变并保持稳定，同时通过分析其他组织免疫组结果强阳性率来分析 MC 株在兔体各个组织的分布规律。C 株与 MC 株接种兔体过程中，在3d、7d、14d 和 21d 四个时间段采取全血，制备血清，进行阻断 ELISA 和间接 ELISA 抗体检测来分析特异性识别 WH303 表位单抗和猪瘟抗体的水平。

重叠PCR

兽医药品监察所硕士学位论文第二章 MC 和 MC-fladdH2O 7.8μL37℃酶切 1h。（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否产生目的大小条带。SacIbp、3800bp、2600bp 和 1300bp 大小片段。BamHI 和 NotI 双酶切应出现约片段。.3.4 PCR 产物测序在菌落 PCR 大小验证和质粒酶切验证都正确之后，将引物 IVDC 297、IVD送测序，得到的测序结果与引物 IVDC 582、IVDC 583 进行序列比对，看是突变的 WH303 位点是否稳定。试验结果.1 297-582、583-300PCR 和重叠 PCR 结果297-582PCR 结果为 472bp 大小片段；583-300PCR 结果为 1617bp 大小片段结果为 2047bp 大小片段。电泳结果如下图，均与预测结果一致。
【学位授予单位】：中国兽医药品监察所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

【参考文献】