绵羊DAO及其突变位点对肾热应激损伤的影响

发布时间：2020-05-21 08:34

【摘要】：热应激是影响南方地区绵羊生产的重要因素,解析热应激的调控机制、选育耐热品种对于减少热应激给绵羊养殖造成的经济损失具有重要的意义。湖羊是江苏省特色绵羊品种,具有产羔多、性成熟早、耐湿热等特点。乌骨绵羊原产于云南南坪,对热应激敏感。课题前期工作中,对热应激敏感组和抗性组湖羊下丘脑进行转录组测序,发现D氨基酸氧化酶基因(DAO)表达差异显著。本论文在此基础上,克隆DAO基因、分析组织表达谱及肾脏中表达定位;研究热应激敏感组和抗性组湖羊肾组织中DAO的表达、氧化应激、凋亡的差异;筛选DAO基因在湖羊和乌骨绵羊群体中的SNPs位点,并通过基因转染,探讨DAO基因及其突变对肾细胞氧化应激的影响,以期为解析绵羊热应激的调控机制提供线索,为热应激品种选育提供候选的分子标记。主要研究内容如下:(1)DAO基因克隆、生物特征及组织表达谱分析:通过PCR扩增,克隆出湖羊D4O基因编码区全序列,长度为1044bp,编码347个氨基酸残基。生物信息学分析发现,哺乳动物DAO种属差异不大,比较保守;湖羊DAO蛋白分子量39238Da,不存在信号肽,等电点6.82,消光系数78755,为亲水性蛋白;含有3个丝氨酸、9个苏氨酸、2个酪氨酸共14个磷酸化位点;含有3个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点;DAO蛋白二级结构由54.2%的氨基酸无规则卷曲、27.4%的氨基酸α螺旋和18.4%的氨基酸β折叠组成。DAO基因具有组织表达特异性,在湖羊肾脏中表达最高,其次为肝脏、下丘脑。免疫组化发现DAO在肾小管的近端小管、远端小管和细段中高表达,而在肾小体中不表达。(2)肾组织DAO表达及其氧化损伤与热应激敏感性的关联:以24h为周期连续240h监测高温季节湖羊直肠温度变化,筛选出热应激敏感、抗性湖羊各5只,适宜环境饲养10天后,42℃急性热应激4h,选择直肠温度变化最大的3只作为热应激敏感组,直肠温度变化最小的3只作为热应激抗性组,采集绵羊肾组织,测定DAO表达及氧化损伤,发现热应激敏感组DAO mRNA表达和H2O2含量均显著高于抗性组(p0.05),也显著高于未热应激对照组(p0.05);热应激敏感组DAO蛋白表达、Caspase 3活性均显著高于抗性组(p0.05),也极显著高于未热应激对照组(p0.01);热应激敏感组Bax/Bcl-2mRNA表达极显著高于抗性组(p0.01),也极显著高于未热应激对照组(p0.01)。这些结果提示热应激可能通过上调DAO表达,导致肾组织氧化损伤和凋亡,湖羊热应激抗性可能与DAO低表达,氧化损伤和凋亡较少有关。(3)过表达DAO对肾细胞热应激损伤的影响:构建DAO真核表达载体pcDNA3.1(+)-DAO,以pcDNA3.1(+)为对照载体,转染肾细胞,热应激处理,发现肾细胞ROS增加,Hsp70表达上升,过表达DAO组ROS和Bax/Bcl-2mRNA表达显著高于对照组(p0.05),Hsp70mRNA表达极显著高于对照组(p0.01),提示过表达DAO通过增加氧化损伤和凋亡加剧了热应激损伤。(4)绵羊DAO突变位点对肾细胞热应激损伤的影响:以耐湿热的湖羊群体和不耐热的乌骨绵羊为研究对象,筛选DAO基因在两绵羊群体中单核苷酸多态性,发现640位点在湖羊和乌骨绵羊群体间基因型频率差异显著,湖羊以GG型为主,乌骨绵羊以AA型为主。构建 AA 型、GG 型过表达载体 pcDNA3.1(+)-DAO-AA 和 pcDNA3.1(+)-DAO-GG,转染肾细胞系,热应激处理,发现热应激下肾细胞ROS增加,转染AA型载体的肾细胞ROS显著高于GG型,热应激处理肾细胞Hsp70和Bax/Bcl-2mRNA表达上升,转染AA型载体Hsp70和Bax/Bcl-2 mRNA表达高于GG型(p0.01),提示DAO基因640位点GG型绵羊对热应激耐受性更好。
【图文】：

氮基,催化反应

茨海默病、脊髓侧索硬化等神经或精神疾病有密切关系，其可能参与这些疾病的发生、展过程，而作用机制与Ｄ－丝氨酸过度激活ＮＭＤＡ受体或者ＮＭＤＡ受体功能低下。研表明，Ｄ氨基酸氧化酶（ＤＡＯ）是消除Ｄ－丝氨酸的主要机制，同时会产生过氧化氢诱氧化应激。伴随活性氧（ＲＯＳ）产生增加，脂质过氧化或抗氧化防御系统的失活。氧化激被认为是导致动物热应激免疫反应受损的关键因素之一。逡逑２邋Ｄ氨基酸氧化酶逡逑２．１邋Ｄ氨基酸氧化酶生化特性逡逑Ｄ氧基酸氧化酶（Ｄ－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｉｄ邋Ｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＯ，ＤＡＡＯ）是一种黄素腺嘿呤二核酸（ＦＡＤ）依赖性酶，催化Ｄ－氨基酸的氧化脱氨基，产生相应的ａ－酮酸、过氧化氢和氨ＤＡＯ催化的反应可分为：（１）还原性半反应，其中ＤＡＯ催化Ｄ－氨基酸脱氢为其亚氨对应物，同时将ＦＡＤ还原为ＦＡＤＨ２。（２）氧化半反应，其中ＦＡＤＨ２被分子氧（生理子受体）再氧化以产生过氧化氢（图１－１中的反应２ａ）邋；邋ＦＡＤＨ２＆可以通过人工电子体体外再氧化，例如一些氧化还原染料（图１－１中的反应２ｂ）。（３）亚氨基酸的自发解反应，得到ａ－酮酸和氨［５＿。逡逑

细胞损伤,解毒酶,谷胱甘肽过氧化物酶,氧化应激

解毒酶如谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶保护细胞免受自由基诱导的损伤，但是过量的逡逑ＲＯＳ产生和抗氧化防御的破坏或消耗导致氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡导致氧化应激逡逑最终会造成细胞损伤（图１－２）。逡逑Ｄ－ＡＡＣＶＦＡＯＨ，邋？邋Ｏ，邋Ｄ－ＡＡＯＦＡＤ邋＊邋Ｈ，０，逡逑？逦２邋Ｈ？０邋？邋Ｏｊ逡逑Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ邋ｄｔｓｍｕｔａｓｅ逦＼逡逑ｈ丨。，，挪。心１0逡逑２邋０，＊？邋？邋２邋Ｈ＊逦／逦ＧＳＨ邋ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ逡逑＼邋ｆ邋逡逑图１－２逦产生过氧化氢对细胞损伤逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｐｅｒｏｘｉｄｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ＤＡＯ邋ｐｒｏｄｕｃｅ邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S826

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