miR-148a-3p靶向PTEN促进家兔前体脂肪细胞分化

发布时间：2020-05-22 23:01

【摘要】：目前,研究表明,miR-148a-3p可以调控前体脂肪细胞的分化以及脂质的形成;PTEN可以通过抑制PI3K-AKT信号通路抑制前体脂肪细胞分化;PTEN是miR-148a-3p的一个潜在的靶基因。本试验旨在建立体外家兔诱导分化模型以及验证miR-148a-3p可以靶向PTEN调控家兔前体脂肪细胞成脂分化。试验结果如下:(1)miR-148a-3p在5月龄家兔肾周脂肪组织中的表达量极显著高于初生仔兔(P0.01);(2)成功分离家兔前体脂肪细胞,鸡尾酒法诱导成脂分化后,油红O染色发现第二天出现大量的小脂滴,第六天开始出现脂滴的汇聚,第十天时,脂滴明显增多,且大脂滴也明显增多,出现成熟脂肪细胞的特征。标志基因测定发现,符合前体脂肪细胞分化规律。随着前体脂肪细胞分化时间的推移,miR-148a-3p的表达量呈逐渐上调的趋势;(3)转染miR-148a-3p类似物mimic后,细胞内miR-148a-3p的表达显著上调(P0.01)。诱导前体脂肪细胞分化,结果显示mimic可以促进前体脂肪细胞分化,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均显著上升(P0.05),脂肪酸和甘油三酯的含量极显著增加(P0.01)。转染miR-148a-3p抑制剂inhibitor,细胞内miR-148a-3p的表达显著下调(P0.05)。诱导前体脂肪细胞分化,结果显示inhibitor可以抑制前体脂肪细胞分化,标志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均显著降低(P0.05),脂肪酸和甘油三酯的含量极显著降低(P0.05)。(4)生物信息学预测结果发现,PTEN基因是miR-148a-3p的一个潜在的靶基因,且有两个结合位点。双荧光素酶报告试验发现,miR-148a-3p可以作用PTEN基因的其中一个位点(P0.01),另一个结合位点并无靶向关系。(5)过表达miR-148a-3p后,可以下调PTEN基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.01)。抑制表达miR-148a-3p后,可以上调PTEN基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05)。(6)抑制家兔前体脂肪细胞内源性PTEN基因的表达量,PTEN表达量下降了约60%,可以促进细胞成脂分化,上调脂肪酸的合成,甘油三脂的含量,分化相关基因C/EBPα、PPARγ和FABP4基因的mRNA水平均显著上升(P0.05),与过表达miR-148a-3p实验结果一致。综上所述,体外家兔诱导分化模型建立成功,且在家兔前体脂肪细胞分化过程中,miR-148a-3p可以通过靶向PTEN基因促进家兔前体脂肪细胞分化。
【图文】：

8a-3p 在不同日龄家兔肾周脂肪中的表达水平（“*”表示 P≤示 P≤0.01；“***”表示 P≤0.005；“****”表示 P≤0.001）iR-148a-3p expression in perirenal fat of rabbits of differentP≤0.05; "**", P ≤0.01; "***", P ≤0.005; "****", P ≤ 0.001)体脂肪细胞的分离培养兔处死后，用酶消化法分离家兔前体脂肪细胞。接圆球状漂浮在培养液中。接种 24h 后，大部分细胞已 后，细胞数量变多，形态更加稳定，呈现出梭形、三别细胞细胞核周围围绕一圈呈花环状的脂滴（图 2，细胞数量不断增多，细胞密度明显增大，前体脂肪列(图 2-C，图 2-D)。结果表明前体脂肪细胞分离培

图 2 家兔原代前体脂肪细胞的分离与培养 （A）24h（100X）；（B）48h（200X）；（C）72h（100X）；（D）120h（100X）。Fig. 2, Isolation and culture of rabbit primary precursor adipose cells (A) For 24 hours(100X); (B) For 48 hours (200X); (C) For 72 hours (100X); (D) For 120 hours (100X)3.3 家兔原代前体脂肪细胞成脂分化模型建立取冻存于液氮中的家兔原代前体脂肪细胞复苏、培养，待前体脂肪细胞密度达到 70%-80%时，用鸡尾酒法诱导家兔前体脂肪细胞分化。并观察细胞生长、分化状态。结果如图 3-A 所示，由于接触抑制生长，细胞开始进入分化状态，少部分细胞已经开始分化，并出现少量的橘红色脂滴，少数细胞内出现花环状脂滴，均匀的分散在整个培养皿中。原代前体脂肪细胞诱导分化 2 天后，染色后发现，培养皿中橘红色脂滴显著增多，，变大，花环状脂滴变多。原代前体脂肪细胞诱导分化 6 天后，培养皿中脂滴显著增多，细胞内的脂滴慢慢融合变大。原代前体脂
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S829.1

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本文编号：2676749