鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查与全基因组序列分析

发布时间：2020-05-23 01:22

【摘要】：近年来我国临床上鸭乙型肝炎(Duck hepatitis B virus,DHBV)的危害日益加重。由于鸭乙型肝炎病毒呈垂直传播,其在种鸭中的持续性感染可能对种蛋孵化和雏鸭造成较大的危害。本研究建立了检测DHBV的核酸探针杂交检测方法,并选取不同区域病死种鸭、肉鸭、死胚和弱雏进行流行病学调查,在此基础上随机选择部分DHBV野毒株进行全基因组测序及序列分析,以期为养鸭业生产中DHBV的科学防控提供参考依据。本研究共分为四部分:1.DHBV在山东、江苏两地发病鸭群的PCR检测从山东、江苏两个省份10个鸭群采集的临床有发病症状的150只病死鸭的心、肝、脾、肺、肾五种脏器。以提取的组织DNA为模板用普通PCR方法检测DHBV的感染情况并统计每个鸭群及各个内脏器官的检出率。结果表明DHBV的群体阳性率为100%,个体阳性率为41.3%。被检测的器官中,肝脏的阳性检出率达100%,其他器官阳性检出率从高到低依次是心脏、脾脏、肺脏和肾脏,分别为77.4%、71.0%、67.7%和66.1%。2.DHBV核酸探针的制备与应用将PCR扩增后测序正确的DHBV C区的一段长423bp的高度保守序列克隆制备成地高辛(DIG)标记核酸探针。特异性试验结果表明,制备的核酸探针只与DHBV的DNA杂交呈阳性,与其他常见病原微生物的DNA杂交呈阴性。敏感性试验结果表明,该探针对DHBV的最低检出量约为3pg DHBV的DNA。应用该探针对从山东、江苏和安徽三个省份16个鸭群采集的150个死胚,150只弱雏以及临床有发病症状的350只病死肉鸭和360只病死种鸭进行检测,结果个体阳性率分别为52%、50.7%、46.9%和45.3%。同时对弱雏的12种内脏器官以及成年鸭的5种器官组织DNA进行检测,结果在被检测的器官中,肝脏的DHBV阳性检出率最高,达100%。将检测结果与上述样品的PCR检测结果进行比较,发现两种检测方法的阳性个体检出符合率为100%,而核酸探针检测的各种器官检出率略低于PCR检测。结果表明,制备的DIG标记的核酸探针特异性强,灵敏度较高,适合对DHBV进行大批量的诊断和流行病学调查。3.DHBV野毒全基因组测序及基因进化分析用普通PCR方法对发病最为严重的6个鸭群随机选取的6株DHBV野毒进行全基因组扩增并测序,随后与其他15株GenBank已发表的全基因组序列进行同源性分析和进化树构建。序列分析结果表明,6株野毒全基因组序列之间的同源性在89.8~99.8%,与其他15株已发表的序列同源性在89.5~99.8%。进化树分析发现6株野毒与中国分离株同属一个分支。6株野毒之间的C蛋白氨基酸同源性在96.6~100%,与其他15株参考毒株同源性在96.2~100%;S蛋白氨基酸同源性在89.7~99.7%,与其他15株同源性在84.8~100%;P蛋白氨基酸同源性在85.3~99.6%,与其他15株同源性在84.8~99.5%。结合进化树分析可以发现,C蛋白与其他毒株最相似,高度保守,S蛋白与P蛋白则异质性较高。4.动物试验对100只3日龄的雏鸭肌肉注射6.6×10~5拷贝/μL的DHBV基因组的阳性血清200μL,置于SPF隔离罩中饲养,每次随机抽取6只采血,采样时间为攻毒后第2天、第3天、第4天、第5天、第7天、第9天、第12天,此后每隔一周采血一次,用SYBR GreenⅠ荧光定量方法检测血液中DHBV病毒载量。检测结果显示在血液中第5天检测出病毒,第12天病毒载量达到峰值,随后逐渐下降,但试验期内无自然转阴现象。剖检可见花斑脾,肝脏出血。
【图文】：

核苷酸序列,基因组结构,负链

进化树可分为两类，“中国基因型”分离株和“西方行分类以外，还可以根据血缘相似性进行分类，根、RGHV、STHBV。对核苷酸序列进行分析后发现因型”分离株的型间差距为 9.8%，型内差距为 5.99%子生物学特征因组结构特点组长 3021~3027bp，是由长链（负链）和短链（正DNA，其所有基因都位于负链。正链的长度不固定50%到 70%，并且没有相应的转录翻译功能。由 11 5’端，这个重复序列被命名为 DR2。DR2 同 DR1 一起的关键区域。有一个缺口存在于 DHBV 基因组的负的聚合酶分子（图 1）。

分布图,病料,分布图,分子病

鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查与全基因组序列分析2 材料和方法2.1 材料2.1.1 病料和菌株来源本试验所用病料分别来自山东、江苏和安徽三个省份 16 个鸭场（图 2）共 30 个批次的 150 个死胚，150 只弱雏，，350 只肉鸭和 360 只种鸭。试验所用的番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）、鸭圆环病毒（duck circovirus, DuCV）、鸭瘟病毒（duck plague virus, DPV）、经典鹅细小病毒（GPV）、鸭疫里默氏杆菌（Riemerellanatipestifer, RA）、大肠杆菌和沙门氏菌等病原均由山东农业大学分子病原学实验室分离保存。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.32

【参考文献】