Ssc-miR-26a靶向ACSL3调控猪肌内脂肪细胞的成脂分化

发布时间：2020-05-23 03:47

【摘要】：肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量作为评价肉质品质的主要指标之一,在猪肉生产过程中非常重要,研究肌内脂肪细胞的脂肪沉积机制可以为畜牧生产提供数据支持。近年来已经有许多miRNAs在脂肪细胞增殖分化中发挥作用的研究,本实验室前期通过高通量测序筛选出许多与脂肪沉积有关的miRNAs,结合ACSL家族成员在肌肉中的相对表达量的结果,通过靶基因在线预测软件双向预测:差异表达的miR-26a-5p和miR-223-3p与乙酰辅酶A合成酶3(ACSL3)可能存在靶向关系。本试验通过双荧光素报告酶系统验证靶向关系,并利用差速贴壁法分离培养来源于背最长肌的猪肌内脂肪细胞,利用过表达,RT-qPCR等技术分析研究miRNA对猪肌内前体脂肪细胞的分化过程的调控作用。本试验的主要结果:(1)沂蒙黑猪不同组织中ACSLs mRNA表达分析:ACSL1主要在肝脏中表达,ACSL3主要在肝脏和肌肉组织中表达,ACSL4主要在肝脏、脾脏中表达,ACSL5和ACSL6在各组织中表达量都较低;在高、低脂组的肌肉组织中,ACSL1、ACSL3、ACSL4均差异表达且达到显著水平(P0.01),ACSL5和ACSL6虽有差异但不显著。(2)ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p在高、低脂组肝脏中均差异表达且达到极显著水平,与高通量测序结果一致。在高、低脂组的肌肉组织中,ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p以及基因ACSL3均差异表达且达到显著水平。(3)双荧光素酶系统报告基因试验结果:将野生型的ACSL3 3蔝TR与miR-26a mimic转染PK15细胞时,检测到的萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值与其他对照组均相比显著降低(P0.01)且其他各对照组之间无明显差异,该结果表明,ACSL3 3蔝TR的种子序列可以与miR-26a-5p的种子序列结合猝灭萤火虫荧光素酶的萤火信号使其与海肾荧光素酶信号的比值降低,从而确定ACSL3与miR-26a-5p存在直接的靶向关系;将ACSL3 3蔝TR野生型双荧光素酶报告载体与miR-223-3p mimic转染PK15细胞时,检测到的萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值与其他各对照组之间无显著差异,从而确定ACSL3与miR-223-3p不存在直接的靶向关系。(4)ACSL3 mRNA水平在IMF细胞分化前期逐渐上升,在分化第2d表达达到高峰(P0.05),随后呈逐渐下降趋势,在6d后进入平台期。(5)转染miR-26a-5p mimic/inhibitor可以影响原代肌内脂肪细胞中ACSL3 mRNA的表达:抑制miR-26a可以显著上调ACSL3 mRNA的表达量(P0.01),过表达miR-26a可以下调ACSL3 mRNA的表达量。(6)过表达miR-26a可以使脂肪细胞分化标志基因PPARγ、SRREBP-1c表达量显著下调(P0.01),表明过表达miR-26a-5p可以抑制猪肌内脂肪细胞的分化。(7)过表达miR-26a后,油红O染色鉴定结果与TG含量测定结果均显示合成脂滴显著减少,表明过表达miR-26a-5p可以抑制猪肌内脂肪细胞脂滴合成。结论:miR-26a通过靶向结合基因ACSL3减少肌内脂肪细胞中甘油三酯(TG)的合成;miR-26a可以抑制猪肌内脂肪细胞的分化。研究结果为进一步研究miRNA对猪肌内脂肪沉积影响的机制提供研究基础。
【图文】：

前体脂肪细胞,甘油三酯,脂肪细胞,脂滴

重要因素(韦克林等,2012)，TG 在肌纤维细胞质中的脂滴中储存的，穿插在纤维束间海燕，姜学，尹靖东,2009)。但在养殖厂猪育肥期间，一般是通过饲喂营养丰富的饲来增加机体内脂肪细胞体积的来完成脂质沉积(姚焰础等,2010)。脂肪细胞是脂肪组织主要组成单位，一般认为前体脂肪细胞由内胚层间充质干细分化为脂肪干细胞，再分化为前体脂肪细胞，并保持一定的干性，如图 1-1(Cawthoal.,2012)。随后在体内一些成脂因子的作用下，梭形的前体脂肪细胞外形转变为圆形细胞内形成脂滴，此时前体脂肪细胞完成定向分化为成熟脂肪细胞的过(Gregoire,2001)。肌内脂肪细胞体积的增大，即脂肪的沉积，也是猪肉大理石纹形成基础。肌内脂肪的沉积，主要指脂肪细胞经过一系列反应合成甘油三酯，最终以脂滴形态沉积在细胞内的过程：一分子甘油三酯由三分子脂肪酸和一个甘油骨架在体内经水缩合而成。与此同时，甘油三酯作为体内能量物质之一提供能量的的代谢速度也会向影响肌内脂肪的沉积。综上，肌内脂肪的沉积总量是体内甘油三酯合成和代谢的综调控结果(Farhad et al.,2018; Wu et al.,2010)。

转录调控因子,脂肪细胞

ssc-miR-26a 靶向 ACSL3 调控猪肌内脂肪细胞的成脂分化节肝脏脂质稳态的一种膜结合蛋白转录因子(李秀秀,2018)，主要调控脂肪酸、甘油三酯和胆固醇的生物合成，共包括 3 个亚型，分别为 SREBP-1a, SREBP-1c 和 SREBP-2。其中 SREBP1 优先调控表达那些与脂肪酸合成有关的基因，而 SREBP-2 主要激活胆固醇的生物合成(Deng et al.,2012)。SREBP-1 及其靶基因的异常表达能够引起胰岛素抵抗、糖尿病和脂肪肝等一系列代谢性疾病(乔辉等,2015)。SREBP 大多以 SREBP-1c 亚基形式存在，一般在脂肪组织和肝脏组织中表达量比较高，SREBP-1c 是一种重要的调控肝脏中的脂肪代谢核转录因子(Frayn et al.,2006)。有研究表明，过表达 SREBP-1c 可以使HepG2 细胞中脂滴的数量变多和甘油三酯的含量上升(刘芳等,2018)。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828

【参考文献】