欧亚类禽H1N1猪流感病毒PB2基因表达新型蛋白鉴定与初步研究

发布时间：2020-05-25 20:51

【摘要】：流感病毒作为单股负链、分节段RNA病毒,可以通过高突变率与基因重排不断产生新型病毒,给公共卫生安全造成巨大威胁。猪作为流感病毒的中间宿主发挥“混合器”的作用,不同来源的流感病毒可以通过感染猪并在其体内发生重排来实现跨物种传播,如2009年爆发的猪源H1N1流感大流行。所以对猪流感病毒监控与分子致病机理等的研究具有重要意义。本研究组在某发病猪场分离得到的一株欧亚类禽H1N1猪流感病毒,经全基因组测序发现其PB2基因的5’端存在一新的开放阅读框(ORF),此ORF编码70个氨基酸,暂定名为PB2-X。为了证明该编码区能够稳定表达PB2-X蛋白,我们将萤火虫荧光素酶报告基因构建在PB2-X ORF后面,通过Mini-genome方法来确定PB2-X的起始密码子能否被病毒vRNPs识别转录并翻译。结果显示病毒vRNPs可以识别并表达PB2-X蛋白。随后为了检测PB2-X蛋白是否在细胞内稳定表达,我们将PB2-X序列克隆到带有flag标签的真核表达载体中,转染293T细胞后检测蛋白的表达情况,结果显示PB2-X蛋白能够在转染细胞中稳定表达。为了进一步鉴定PB2-X蛋白在病毒复制过程中是否被表达,我们利用合成的PB2-X多肽免疫小鼠制备成多抗,最终结果显示在病毒复制的早期PB2-X可以被检测到,但水平较低。为进一步探究PB2-X蛋白功能,我们对携带与不携带PB2-X的病毒生物学特性进行比较,由于本研究分离到的欧亚类禽H1N1猪流感病毒对小鼠没有致病性,换以经典H1N1猪流感病毒(CH1N1)为骨架,在不改变PB2氨基酸序列的前提下,人为引入了PB2-X,成功拯救出CH1N1-PB2-X突变病毒。通过比较原始毒株(CH1N1-WT)与含有PB2-X的突变毒株在ST与MDCK细胞上的生长曲线,发现CH1N1-PB2-X的复制能力强于CH1N1-WT,说明PB2-X有利于病毒的复制。将CH1N1-WT与CH1N1-PB2-X接种小鼠,结果CH1N1-WT对小鼠的致病性显著强于CH1N1-PB2-X,说明PB2-X的存在对病毒在小鼠上的致病性起到致弱作用。为了进一步研究PB2-X影响病毒复制与致病性的分子机制,我们检测了PB2-X对H1N1病毒聚合酶活性的影响。利用Mini-genome方法检测发现,过表达PB2-X蛋白可以抑制聚合酶活性。进一步研究发现PB2-X影响聚合酶活性的原因是其过表达后抑制了Mini-genome中聚合酶蛋白(如PB2,NP)真核表达质粒的蛋白表达造成的,而这些蛋白都是利用CMV启动子驱动基因转录与翻译的,对PB2基因的mRNA检测结果显示,PB2-X对PB2基因的mRNA水平影响不明显,此结果显示PB2-X蛋白可能具有抑制宿主mRNA的翻译过程。为了进一步验证这种抑制作用是否具有广谱性,我们将PB2-X真核表达质粒或者空载体质粒分别与含有CMV启动子的EGFP表达质粒共转染293T细胞,发现PB2-X蛋白可以抑制EGFP蛋白的表达,说明PB2-X具有抑制宿主蛋白翻译系统的功能。本研究对一株欧亚类禽H1N1猪流感病毒上发现的新型PB2-X蛋白进行鉴定与其功能的初步研究,为进一步研究欧亚类禽猪流感病毒致病机理与防控提供参考。
【图文】：

图 1.1 流感病毒结构图 (Vaccines 2015, 3(2), 373-389)Figure 1.1 Structure of the influenza virus染宿主过程主第一步就是 HA 蛋白与宿主细胞表面的唾液酸受体结

图 1.2 流感病毒生活史(von Itzstein, 2007)Figure 1.2 Life cycle of the influenza virus1.3 流感病毒编码蛋白与功能1.3.1 流感病毒编码主要蛋白
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2680729