羊口疮病毒环介导等温扩增高效检测方法的建立

发布时间：2020-05-28 12:17

【摘要】：羊口疮(ORF)的快速诊断对于该病的防控至关重要,而环介导等温扩增(LAMP)技术可以满足对羊口疮病毒(ORFV)高效性的现场检测需求。本试验对ORFVVIR基因扩增,通过优化反应条件,对LAMP检测ORFV进行了显色反应、特异性和灵敏性的检测,并进行了后续的临床检测。结果显示,利用优化的LAMP染色法,将呈现绿色的阳性组与橙色的阴性组区分开。对扩增的质粒和阳性对照样品的检测呈现出了阳性条带,而对山羊痘、绵羊痘、牛传染性鼻气管炎和牛副流感3型病毒的检测并无阳性条带。优化的LAMP检测ORFV的灵敏度比传统PCR高出1 000倍。对15份临床样品检测的结果表明,优化的LAMP电泳和染色法对ORFV的检出率均为100%,与传统PCR检测结果相一致。上述结果表明优化的LAMP对ORFV的检测具有特异性、高灵敏性且更加方便等优点,从而更适用于现场的高效检测。
【图文】：

ＬＡＭＰ条件优化的内容包括：Ｍｇ２＋用量、甜菜碱的用量、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶的用量、ｄＮＴＰｓ的用量、内外引物的浓度、ＬＡＭＰ方法检测阳性模板反应的最佳时间和最佳温度这７个方面。其中，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分别为１．５，２，２．５，３，３．５，４μＬ；甜菜碱（１ｍｏｌ／Ｌ）的用量分别为０，２，３，５，６，７μＬ；ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（８０００Ｕ／ｍＬ）的用量分别为０．５，１，１．５，２，３μＬ；ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分别为１，２，３，，４，５，６μＬ；内引物的浓度分别为１０，２０，４０，８０μｍｏｌ／Ｌ，外引物的浓度为５μｍｏｌ／Ｌ。通过上述各自试验的结果进行选择并组合，选择最佳ＬＡＭＰ反应体系。反应时间分别为３０，４５，６０，９０，１２０ｍｉｎ；反应温度分别为５９．４，６０．６，６２．０，６３．０，６４．０，６５．１℃。对ＬＡＭＰ扩增产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳分析。１．４ＬＡＭＰ显色法检测ＯＲＦＶ将上述优化的条件结果进行整合，进行ＬＡＭＰ扩增，用５００×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ对反应体系进行不开盖显色反应。１．５ＬＡＭＰ检测ＯＲＦＶ的特异性利用条件优化的ＬＡＭＰ，通过与ＧＰＶ、ＳＰＶ、ＩＢＲＶ和ＢＰＩＶ３的ＤＮＡ检测作对比，对ＯＲＦＶ检测的特异性进行试验。１．６ＬＡＭＰ检测ＯＲＦＶ的灵敏性梯度稀释ＯＲ－ＦＶ阳性质粒用于ＬＡＭＰ灵敏性检测，并与传统的ＰＣＲ灵敏性

ＬＡＭＰ条件优化的内容包括：Ｍｇ２＋用量、甜菜碱的用量、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶的用量、ｄＮＴＰｓ的用量、内外引物的浓度、ＬＡＭＰ方法检测阳性模板反应的最佳时间和最佳温度这７个方面。其中，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分别为１．５，２，２．５，３，３．５，４μＬ；甜菜碱（１ｍｏｌ／Ｌ）的用量分别为０，２，３，５，６，７μＬ；ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（８０００Ｕ／ｍＬ）的用量分别为０．５，１，１．５，２，３μＬ；ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分别为１，２，３，４，５，６μＬ；内引物的浓度分别为１０，２０，４０，８０μｍｏｌ／Ｌ，外引物的浓度为５μｍｏｌ／Ｌ。通过上述各自试验的结果进行选择并组合，选择最佳ＬＡＭＰ反应体系。反应时间分别为３０，４５，６０，９０，１２０ｍｉｎ；反应温度分别为５９．４，６０．６，６２．０，６３．０，６４．０，６５．１℃。对ＬＡＭＰ扩增产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳分析。１．４ＬＡＭＰ显色法检测ＯＲＦＶ将上述优化的条件结果进行整合，进行ＬＡＭＰ扩增，用５００×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ对反应体系进行不开盖显色反应。１．５ＬＡＭＰ检测ＯＲＦＶ的特异性利用条件优化的ＬＡＭＰ，通过与ＧＰＶ、ＳＰＶ、ＩＢＲＶ和ＢＰＩＶ３的ＤＮＡ检测作对比，对ＯＲＦＶ检测的特异性进行试验。１．６ＬＡＭＰ检测ＯＲＦＶ的灵敏性梯度稀释ＯＲ－ＦＶ阳性质粒用于ＬＡＭＰ灵敏性检测，并与传统的ＰＣＲ灵敏性

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本文编号：2685229