小鼠miR-146a-5p在多房棘球蚴感染中的免疫调节作用

发布时间：2020-05-29 07:36

【摘要】：棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球属绦虫(Echinococcus spp.)的幼虫——棘球蚴寄生于牛、羊及人的肝、肺等组织器官而引起的一种重要的人兽共患寄生虫病。多房棘球绦虫的中绦期幼虫——多房棘球蚴可寄生于啮齿动物和人,引起泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)。microRNAs(miRNAs)是一类具有调节功能的小RNA分子,大量数据表明它们在寄生虫生长发育及其抗感染免疫过程中发挥重要作用。因此,开展小鼠miRNA分子在多房棘球蚴感染过程中的相关研究,不仅能够揭示其致病机理,而且对寻找新的药物靶标具有重要意义。鉴于此,主要开展了以下几个方面的研究:建立多房棘球蚴的BALB/c小鼠感染模型。间接ELISA和不同感染时期的剖检结果均显示,小鼠感染率保持在38%左右。以此为基础,从细胞凋亡入手,利用流式细胞术首先检测感染多房棘球蚴三个月小鼠脾脏细胞的凋亡水平,结果表明,与对照组小鼠(腹腔注射PBS)相比,实验组小鼠(腹腔注射原头蚴)脾脏细胞的凋亡水平显著下降(P0.05)。为探究脾脏细胞凋亡发生改变可能的分子机制,利用高通量RNA-seq测序技术,分析脾脏细胞中的miRNAs表达谱,结果发现7种miRNA分子呈差异表达,miR-124-3p、miR-9-5p、miR-129-2-3p、miR-1a-3p、miR-128-3p(表达上调)、miR-16-5p和miR-146a-5p(表达下调)。生物信息学进一步分析发现,miR-146a-5p的靶标分子中有13种分子与免疫或细胞凋亡相关,如TLR3、IRAK1、NFAM1、IRAK2、TRAF6和BAG-1等等,故选择该miRNA分子进行深入研究。分离不同感染时期小鼠脾脏细胞,利用qPCR确定不同感染时期miR-146a-5p表达水平的变化。结果显示,与对照组相比,在感染后第二个月(P0.01)和第三个月(P0.05),miR-146a-5p的表达水平均显著下调,而在第一个月时,其表达水平基本不变,表明在多房棘球蚴感染过程中,miR-146a-5p表达呈现动态变化。为进一步探究小鼠miR-146a-5p的免疫调节作用,利用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7分别转染miR-146a-5p阴性对照物、模拟物和抑制物,测定细胞因子、TLR4/LPS信号通路中的关键基因、iNOS的转录水平和NO含量。结果显示,过表达和抑制miR-146-5p表达时,部分细胞因子和TLR4/LPS信号通路上的关键基因的转录水平呈现相反的趋势,同样,iNOS转录水平和NO含量也呈现相反的变化。以上结果显示,小鼠miR-146a-5p可能对巨噬细胞具有免疫调节作用。利用RAW 264.7细胞分别转染miR-146a-5p阴性对照物、模拟物和抑制物,qPCR和Western blot初步确定BAG-1(抗凋亡基因)为miR-146a-5p的靶标基因。分离不同感染时期小鼠脾脏细胞,利用qPCR测定不同时期BAG-1基因的变化,结果显示,BAG-1在感染的第2个月和第3个月显著上调(P0.05),这与小鼠miR-146a-5p表达水平的趋势刚好相反,进一步提示BAG-1可能是miR-146a-5p的靶标基因。双荧光素酶报告系统的检测结果显示,小鼠miR-146a-5p能与BAG-1 mRNA的3'-UTR特异性结合,而与BAG-1 mRNA的突变体不结合。以上结果表明,miR-146a-5p能与BAG-1 mRNA的3'-UTR特异性结合,抑制其表达。进一步分析感染多房棘球蚴一个月、两个月时的小鼠脾脏细胞的凋亡水平,结果表明,BALB/c小鼠感染多房棘球蚴两个月时,与对照组相比,脾脏细胞凋亡水平显著下降(P0.01),而在感染虫体一个月时,细胞凋亡水平基本没有变化。对正常脾脏细胞分别转染miR-146a-5p阴性对照物、模拟物和抑制物,检测细胞凋亡水平,结果表明,与抑制物转染组相比,模拟物转染组的脾脏细胞凋亡水平显著升高(P0.05)。以上结果表明,miR-146a-5p可能参与调节小鼠脾脏细胞的细胞凋亡。综上所述,在多房棘球蚴感染BALB/c小鼠的过程中,小鼠脾脏细胞miR-146a-5p的表达显著下调,导致其靶标基因BAG-1的表达显著上调,抑制脾脏细胞凋亡的发生,从而调节机体免疫应答。
【图文】：

凋亡,对照组,小鼠脾脏细胞,实验组

图 1.1：间接 ELISA 确定 BALB/c 小鼠的感染率Figure 1.1 Determination of the infectious rate of BALB/c mice using indirect ELISA2.3.2 凋亡结果分析用毛细管流式细胞分析仪对每份处理好的细胞样品进行检测，并用 Guava 软件对细胞凋亡水平进行统计学分析，结果如图 1.2 所示，加入凋亡阳性诱导剂的实验组和对照组小鼠的脾脏细胞明显发生凋亡，凋亡率接近 90%。感染多房棘球蚴 3 个月时，与对照组小鼠的脾脏细胞相比，，实验组脾脏细胞凋亡水平显著下降（P < 0.05，图 1.2）。

感染率,间接ELISA,小鼠,小鼠模型

科学院硕士学位论文第二章多房棘球蚴不同感染时期miR-146a-5p表达即当实验组血清 OD450平均值+2×标准方差（Mea+2SD）>1.640 时可认定为阳性。46 只 BALB/c 小鼠为阳性，感染率为 38.4%（图 1.1）。这与后续不同感染时期的实一致。感染多房棘球蚴的 BALB/c 小鼠模型的成功建立，为后续动物实验的正常。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S855.99

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