MiR-132-3p靶向UCP2调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

发布时间：2020-05-30 07:45

【摘要】：绵羊是一种反刍肉用家畜,作为肉质品质的重要指标,其胴体脂肪含量是人们关注的热点。降低绵羊胴体脂肪含量是肉羊遗传改良的重要育种目标。解偶联蛋白UCP2是UCPs家族成员之一,也是促进脂肪分解的关键蛋白之一,当机体开始以脂肪组织为主要能源物质时,血液中的脂肪酸和酮体含量相应升高,脂肪酸会促进UCP2mRNA的表达,继续加强脂肪的分解速度。MicroRNA(miRNA)通过调节功能基因对绵羊肉质的影响也成为近年来的研究热点。miRNA主要通过与靶基因mRNA的完全和不完全结合,使靶基因的mRNA表达量下降或者降解mRNA。培养和诱导分化绵羊前体脂肪细胞是研究miRNA调控绵羊脂肪代谢的有效手段,所以,鉴定绵羊前体脂肪细胞以及研究绵羊前体脂肪细胞分化过程中的影响因素是后续试验进行的必要条件。本研究旨在探究tmiR-132-3p对绵羊前体脂肪细胞中UCP2基因的表达调控机制。通过添加不同浓度胰岛素的培养基对绵羊前体脂肪细胞进行不同时长的处理,确定绵羊前体脂肪细胞出现胰岛素抵抗的条件以及绵羊前体脂肪细胞分化过程中对不同浓度胰岛素刺激的应答情况;然后利用油红O染色和脂肪细胞分化标志基因的表达量对绵羊前体脂肪细胞的分化潜能进行鉴定:同时在绵羊前体脂肪细胞分化的不同时期,提取细胞的RNA,用RT-qPCR技术检测绵羊前体脂肪细胞分化过程中miR-132-3p和UCP2的表达量;分别利用三个不同的生物信息学软件分别预测可以与UCF2特异性结合的miRNAs,取交集得到可以潜在结合UCP2的miRNA;构建UCP2 3'-UTR的双荧光素报告载体pmirGLO-UCP2-3'-UTR,转化Trans 5α感受态细胞,提取并纯化重组质粒;利用双酶切技术、菌液PCR技术、测序技术对pmirGLO-UCP2-3'-UTR双荧光素报告载体进行鉴定;将pmirGLO-UCP2-3'-UTR和miR-132-3p的mimics共转染进HEK-293T细胞,检测相对荧光活性,进而验证miR-132-3p与UCP2的靶标关系;然后在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-132-3p的mimics并设立阴性对照NC组,提取总RNA和总蛋白后,用RT-qPCR、Westem blotting技术检测过表达后UCP2 mRNA和蛋白的表达,同时检测绵羊前体脂肪细胞分化过程中标志基因的表达量。(1)试验发现诱导绵羊前体脂肪细胞分化的过程中标志基因的表达量逐渐上升。脂滴越来越多,越变越大,进行油红O染色后,细胞轮廓清晰,胞浆内可见红色脂滴聚集,表明细胞具有分化为成熟绵羊脂肪细胞的潜能。通过添加不同浓度的胰岛素试验发现细胞在10-9mM、10-8mM浓度胰岛素培养条件下,随着胰岛素浓度的升高,细胞对葡萄糖的吸收量也随之增加。在10-7mM浓度胰岛素培养条件下,24 h内细胞对胰岛素的刺激有明显的应答反应,随着处理时间增加,对葡萄糖的吸收量也相应增加,在处理48h时,细胞不能对胰岛素的刺激做出正常反应,葡萄糖的吸收量也无明显变化。10-6mM浓度的胰岛素处理后的细胞活性开始降低,细胞的死亡率升高。说明绵羊前体脂肪细胞在10-9mM、10-8mM浓度胰岛素培养条件下有剂量依赖性,10-7 mM浓度胰岛素处理48h时出现胰岛素抵抗。(2)生物信息学软件预测得到可以与UCP2结合的miRNA有miR-132-3p和miR-212-3p,在双酶切重组质粒和菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图上可以清晰地看到出现目的片段,说明重组质粒中包含有UCP2 3'-UTR目的片段;重组质粒与miR-132-3p共转染后检测到mimics组的相对荧光活性显著低于(P0.05)NC组和Blank组的相对荧光活性,直接证明miR-132-3p可以与UCP2 3'-UTR结合,说明miR-132-3p和UCP2存在靶标关系。(3)绵羊前体脂肪细胞分化过程中miR-132-3p和UCP2基因的表达量在细胞分化的前期和中期呈现负相关关系。过表达miR-132-3p后,UCP2mRNA在过表达组中的表达量显著低于(P0.05)阴性对照组,说明miR-132-3p对UCP2在mRNA水平上有负调控作用;Westernblot表明,UCP2蛋白在过表达组中的表达量显著低于(P0.05)阴性对照组,说明miR-132-3p对UCP2在蛋白水平上也有负调控作用。
【图文】：

前体脂肪细胞,绵羊,细胞

２．１前体脂肪细胞的生长状态逡逑对消化后的细胞进行培养，体外培养的细胞大多只呈现出上皮样细胞形态逡逑和成纤维细胞养形态，如图２－ｌａ所示，６ｈ后在显微镜下观察到的细胞紧贴培逡逑养皿底部生长，且出现了成梭形或者星形的细胞形态，，且有的细胞形态类似于逡逑长了两三个触角，初步确定本研究中培养的细胞为绵羊的前体脂肪细胞。图逡逑２－ｌｂ所示为培养２邋ｄ后细胞长满培养皿底部后的图像。逡逑２４逡逑

胰岛素抵抗模型,脂滴,绵羊,脂肪细胞

Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｉｄ邋ｎｏｔ邋ｒｅｓｐｏｎｄ邋ｔｏ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；邋Ｂ：邋Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ逡逑２．５前体脂肪细胞的分化和染色逡逑图２－３显示的是绵羊前体脂肪细胞不同分化时间点的细胞形态。图中的ａ，逡逑ｂ，ｃ，ｄ分别代表细胞分化了邋２ｄ，４邋ｄ，邋６邋ｄ，邋８邋ｄ。可以直观的看到，随着绵羊逡逑前体脂肪细胞的分化天数，脂滴积少成多，且脂滴变得越来越大，填充在细胞逡逑之间。逡逑对其进行油红０染色，可从图２－４看出，图中的ａ，邋ｂ，邋ｃ，邋ｄ分别代表细逡逑胞分化了邋２ｄ，４邋ｄ，邋６邋ｄ，邋８邋ｄ。油红０所染的红色面积随着诱导分化的天数越逡逑来越大，且区域也越来越多。这些结果表明，培养的细胞随着诱导分化的时间逡逑延长，出现的脂滴越来越多，且脂滴变得越来越聚集。由２ｄ的零星脂滴分布逡逑到８ｄ的脂滴聚集，以及大量脂滴生成来看，培养的细胞有分化出脂滴的能力，逡逑且几乎全部分化为成熟的脂肪细胞。说明了本批采样消化得到的细胞为前体脂逡逑肪细胞
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826

【参考文献】