乙型脑炎病毒E-I176R突变位点致弱其神经毒力研究

发布时间：2020-06-01 01:39

【摘要】：乙型脑炎病毒(JEV)是流行性乙型脑炎的病原体。本研究旨在进行JEV关键毒力位点分析、鉴定E-I176R(E蛋白第176位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸)突变位点能否影响其神经毒力。首先,分析预测了JEV神经毒力相关突变位点6个。在进行了JEV SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株的全基因序列测定的基础上,进行了其神经毒力的鉴定,分析获得了JEV神经毒力相关氨基酸突变位点6个:E蛋白A72T、I176R、S251Y、E273K,NS2B蛋白V44A和NS4A蛋白G168E。其次,成功拯救了JEV E-I176R单点突变病毒。利用定点突变和反向遗传操作方法构建并包装了JEV E-I176R单点突变病毒,利用蚀斑形成试验、PCR、序列测定等方法对包装的病毒进行了鉴定,在BHK-21细胞进行了体外生长特性的研究,发现目标点突变对JEV的蚀斑形成特性与生长曲线没有显著影响。最后,阐明了乙型脑炎病毒E-I176R突变位点能够显著降低其神经毒力。将84只小鼠平均分为14组进行神经毒力实验,每个病毒滴度重复3次进行验证,发现200与2000PFU的未突变病毒引起小鼠的死亡率分别为55.56%与88.89%,而200与2000PFU的E-I176R单点突变病毒引起小鼠的死亡率分别为11.11%与50%。荧光定量检测结果显示,未突变病毒在鼠脑内含量在攻毒后3、5、7天逐渐升高,而E-I176R单点突变病毒在3、5、7天保持稳定。本研究分析出了6个JEV神经毒力相关氨基酸突变位点,证实了E-176为影响乙脑病毒毒力的关键位点,E-I176R单点突变能够能显著降低其神经毒力。本研究为乙脑病毒致弱机制的深入研究奠定了基础。
【图文】：

模式图,乙脑,点突变,模式图

2.1.3 病毒神经毒力的测定将 SPF 三周龄雌性小鼠以 6 只为一组于动物房中饲养一天，将已测病毒滴度的SCYA201201-1 与 SCYA201201-0901 病毒液 10 倍梯度稀释至 10~107PFU/ml 浓度备用使用微量注射器以 30ul 的剂量对小鼠进行脑内接种，每个浓度接种一组小鼠，持续观察小鼠有无出现神经症状 21 天，，记录每日小鼠死亡数。2.1.4 序列比对分析使用DNAMAN软件分析SCYA201201-1与SCYA201201-0901乙脑毒株全长核苷酸序列与编码的氨基酸，并与一株 I 型弱毒株 Mie/41/2002 (GenBank 登录号：AB241119)，两株 I型强毒株 HEN0701 (GenBank 登录号：FJ495189)与 SX09S-01 (GenBankno 登录号HQ893545) 进行比对。2.2 乙脑 E-I176R 点突变感染性克隆质粒的构建

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2.2.6 载体连接计算胶回收得到的感染性克隆载体片段和点突变 E 基因片段浓度，按照 1:3,1:5,1:7的浓度计算加入的核酸体积，使用 DNA 连接专用的试剂盒连接操作。具体连接反应体系如下表所示（表 8）。表 8 T4 DNA 连接酶反应体系Table 8 T4 DNAligase reaction volume试剂名称体积（μl）乙脑 E 基因目的片段胶回收溶液 3.0乙脑感染性克隆低拷贝载体胶回收溶液 1.0T4 连接酶 1.02×T4 Buffer 5.0总体积 10.0反应温度 16℃，过夜进行连接反应后，于 4℃冰箱中保存。2.3 乙脑 E-I176R 点突变病毒的包装
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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