猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋耐药判定标准研究

发布时间：2020-06-01 07:33

【摘要】：猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoinae,APP),原称胸膜肺炎嗜血杆菌,易引起猪呼吸道疾病传染性胸膜肺炎,不同年龄段的猪都有易感性且死亡率较高。随着国内动物抗生素的滥用,一些治疗该疾病的药物的治疗效果已经大大降低,所以需要我们通过合理的用药来减少耐药性的产生。头孢噻呋是第一个用于动物的第三代头孢类抗生素,对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均有效,对动物呼吸道细菌具有良好的临床治疗效果。为了降低猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药性的产生,需要我们对猪胸膜肺炎放线杆菌开展耐药监控措施。通过建立猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药判定标准,能够有效科学的对耐药进行监控。本课题通过测定头孢噻呋对135株猪胸膜肺炎放线杆菌的药物敏感性,建立了野生型临界值:检测体外和半体内条件下头孢噻呋对临床分离的致病性菌株的抗菌作用,研究头孢噻呋在猪体内的药动学,建立PK-PD模型,制定出最佳的给药方案,建立药效学临界值。研究头孢噻呋对不同MIC致病性菌株所致感染疾病的治疗效果,建立头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的临床临界值,制定头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌检测标准,为猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药提供合理的科学的判定依据。1.头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学研究及野生型临界值的制定采用琼脂稀释法测定头孢噻呋对135株临床分离的猪胸膜肺炎放线杆菌的药物敏感性,通过ECOFFinder软件分析最低抑菌浓度(MIC)分布。然后用微量肉汤稀释法测定头孢噻呋在TSB肉汤培养基和猪血浆中对猪胸膜肺炎放线杆菌BW39菌株的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度(MBC),同时在体外条件下测定头孢噻呋对BW39菌株的最小防突变浓度(MPC)以及抗菌后效应(PAE),在含有不同浓度头孢噻呋的培养基和猪血浆中进行体外和半体内杀菌曲线的测定。头孢噻呋对135株猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC分布范围在0.0075-4 μg/mL之间,MIC50和MIC90分别为0.015 μg/mL和0.5μg/mL,制定的野生型临界值为0.125μg/mL。体外和半体内条件下头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌BW39的MIC分别为0.5 μg/mL 和 1 μg/mL,MBC 均为 1 μg/mL,MPC 为 1.6 μg/mL,耐药突变选择窗(MSW)为0.5-1.6μg/mL,头孢噻呋与猪胸膜肺炎放线杆菌暴露1 h产生的PAE为0.33-0.66 h,暴露2 h产生的PAE为0.73-1.17 h。体外和半体内杀菌曲线试验结果均显示头孢噻呋对BW39菌株的抗菌作用类型为时间依赖型。2.头孢噻呋在猪体内的药动学研究及药效学临界值的制定试验选取12头体重15 kg左右的健康断奶二元杂交仔猪,随机分为2组,每组6头。对健康组和患病组均按照5 mg/kg·b.w剂量肌肉注射盐酸头孢噻呋。给药后于不同时间点采集血浆,采用高效液相色谱(HPLC)法检测药物浓度。通过半体内PK-PD模型拟合以及剂量计算公式,制定出最佳的给药方案。同时利用蒙特卡罗模拟方法对药动学数据进行模拟分析,得到药效学临界值。根据药动学数据选择最佳的PK-PD参数,构建头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的半体内PK-PD模型,通过Sigmoid Emax模型方程对半体内杀菌曲线中AUC/MIC值和细菌对数变化量之间的关系进行拟合,计算得到健康组中抑菌、杀菌、清除效果下的AUC/MIC值分别为45.73、63.83、69.04 h,患病组中抑菌、杀菌、清除效果下的AUC/MIC值分别为38.94、47.23、49.16 h。通过剂量计算公式得到健康组和患病组预防、治疗、根治目的下的剂量分别为2.2、3.0、3.3 mg/kg·b.w和1.8、2.2、2.3 mg/kg·b.w。利用蒙特卡罗方法对AUC的均值和标准差进行模拟,得到头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学临界值为2 μg/mL。3.头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌临床临界值及耐药判定标准的制定将36头仔猪随机分为6组,1组为阴性对照组,5组为药物治疗组,每组6头。选择具有致病力的5株不同MIC猪胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒试验,建立人工感染患病模型。不同菌株攻毒的猪只进行治疗,统计治愈率和死亡率,利用数学统计算法WindoW和CART模型以及非线性回归分析,制定临床临界值。根据折点制定树状图,建立头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药判定标准。选择编号为 BW9,BW29,BW39,QG17 和 18119,MIC 分别为 0.015 μg/mL、0.125μg/mL、0.5 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL的5株猪胸膜肺炎放线杆菌分别对试验组进行攻毒,然后对感染仔猪进行肌肉注射头孢噻呋3mg/kg.b.w,一天一次,连续三天的给药治疗,得到头孢噻呋对上述5株菌株的治愈率分别为100%、83%、83%、67%和50%,通过WindoW和CART算法分析模型确定临床临界值的分布范围为0.5-1.25μg/mL,最后通过非线性回归分析方法,制定头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的临床临界值为0.5-1.25 μg/mL。结合获得的野生型临界值、药效学临界值和临床临界值,最终建立猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药判定标准为0.5-1.25 μg/mL。本课题参考美国临床和实验室标准化协会(CLSI)和欧洲药敏试验联合委员会(EUCAST)组织公布的标准程序,建立了猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药判定标准。为猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药监控提供科学的理论依据,有利于保护和维持头孢噻呋在临床治疗中的有效性。
【图文】：

树状图,折点,树状图,敏感性

耐药判定标准又称折点或者解释标准，用来定义细菌对抗菌药物是否敏感，最小抑菌浓度（ＭＩＣ）或者抑菌圈直径（ｍｍ）来表示。ＣＬＳＩ邋（Ｓｔａｓｓ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５）将敏感性折点（Ｓ），中介（Ｉ）和耐药（Ｒ），欧盟则分为敏感或者耐药。根据ＣＬＳＩ０－Ｓ１７给出的定义：敏感是指通过正常的给药剂量，，药物在血浆或者靶组抑制细菌的生长，中介是指在给药后，药物在血浆或者靶组织中药物对细抑制速度相对于敏感细菌生长更慢一些，耐药是指在药物在血浆或者靶组的生理药物浓度不能抑制细菌的生长。逡逑国际上折点的制定主要包括三个部分，即野生型临界值（ＣＯｗｒ／ＥＯＦＦｓ），药／药效临界值（ＣＯＰＤ），临床临界值（Ｃ0ａ＿），最终通过人用药物耐药判定标准生型临界值，药动学临界值，临床临界值来确定最终的折点值，判定方法

核苷酸序列,猪胸膜肺炎放线杆菌,条带

３．邋１．邋１猪胸膜肺炎放线杆菌ＰＣＲ鉴定逡逑猪胸膜肺炎放线杆菌通过扩增特异性基因核苷酸序列ＩＶ毒素基因进行特异性逡逑鉴定，特异性鉴定结果见图２。本试验选择扩增的条带为３７７邋ｂｐ。如图所示，在５００逡逑ｂｐ到２５０邋ｂｐ间只有猪胸膜肺炎放线杆菌出现特异性扩增条带，表明所选引物为猪胸逡逑膜肺炎放线杆菌的特异性引物，可用于猪胸膜肺炎放线杆菌的ＰＣＲ特异性鉴定。逡逑图２猪胸膜肺炎放线杆菌ＰＣＲ鉴定条带逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｉ邋Ａｃｔｉｎｏｈａｃｉｌｌｕｓ邋ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｒｎｏｉｎａｅ逡逑注：Ｍ邋为邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，从下到上的条带依次邋２０００邋ｂｐ，１０００邋ｂｐ，７５０邋ｂｐ．邋５００邋ｂｐ，邋２５０邋ｂｐ，１００邋ｂｐ；阳为阳性逡逑对照；阴为阴性对照．逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｍ邋ｉｓ邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋ｔｈｅ邋ｂａｎｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｂｏｔｔｏｍ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｔｏｐ邋ｉｓ２０００邋ｂｐ，邋１０００邋ｂｐ，邋７５０邋ｂｐ．邋５００邋ｂｐ，邋２５０邋ｂｐ．邋１００逡逑ｂｐ；邋“阳”邋ｉｓ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋“阴”邋ｉｓ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑３．邋１．２敏感性测定结果逡逑采用ＣＬＳＩ推荐的琼脂稀释法测定头孢噻呋对１３５株猪胸膜肺炎放线杆菌的逡逑ＭＩＣ。其中质控菌株大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２的ＭＩＣ结果为０．５－ｌ＾ｇ／ｍＬ，在质控范围逡逑０．２５－１邋ｐｇ／ｍＬ之内
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

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