分子马达对狂犬病病毒胞内感染影响的初步研究

发布时间：2020-06-02 07:56

【摘要】：狂犬病病毒(RABV)是弹状病毒科狂犬病毒属的一种单股负链RNA病毒,能引起人和动物发生高度致死性狂犬病。病毒粒子由核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)组成。N、P、L蛋白包裹病毒RNA基因组构成核糖核蛋白复合物(RNPs),N蛋白与基因组RNA结合,能够保护病毒RNA免于被降解;M蛋白与包膜下的RNPs相互作用,有助于病毒粒子组装;G蛋白能够识别细胞表面受体,在RABV与胞膜融合及胞内运输过程中起重要作用。尽管对RABV研究众多,但微管和马达分子对RABV胞内感染的影响还有待深入研究。本研究首先使用微管抑制剂Nocodazole预处理N2a细胞,然后进行RABV感染。分别采用RT-qPCR、Western blot检测RABV N基因及蛋白表达量,通过免疫荧光观察Nocodazole处理对RABV在N2a细胞的感染率及上清中病毒TCID_(50)滴度的影响,研究微管在RABV感染中的作用。随后N2a细胞感染RABV12 h后,用Nocodazole处理,收集不同处理时间样品,进行RT-qPCR、TCID_(50)检测,分析病毒出胞时间及微管对病毒出胞过程的影响。为验证dynein分子马达在RABV感染中的作用,通过特异性抑制剂Na_3VO_4处理或马达复合物亚基成分的重组质粒pcDNA4.0-myc-CC1和pcDNA3.1-flag-p50转染细胞,检测RABV N基因、蛋白表达量及上清病毒滴度,评价dynein在RABV感染中的作用。另外,还通过转染重组质粒pcDNA3.1-flag-KHCct,检测了分子马达kinesin-1在RABV感染中的作用。通过内质网标志蛋白CNX、PDI与RABV结构蛋白共定位来检验内质网是否参与RABV感染。结果显示,Nocodazole预处理抑制了微管形成,使RABV N基因拷贝数降低约25%、N蛋白降低约50%,病毒感染率降低约70%,上清液中病毒滴度由10~(6.5)TCID_(50)/mL下降至10~(4.5)TCID_(50)/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于微管骨架的参与。RABV感染后用微管抑制剂处理也得出相似结论。Na_3VO_4预处理抑制dynein,RABV N基因降低约60%、N蛋白降低约45%,病毒感染率降低约75%,上清病毒滴度由10~(7.5)TCID_(50)/mL降至10~(5.5)TCID_(50)/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于逆向运输分子马达dynein参与。重组质粒pcDNA4.0-myc-CC1、pcDNA3.1-flag-p50的表达均可竞争性抑制dynein功能,N基因分别降低约75%、40%,N蛋白降低约50%、70%,单细胞内病毒感染率均显著减少,上清液中病毒滴度分别由10~(7.5)TCID_(50)/mL降至10~(5.5)TCID_(50)/mL、10~(7.0)TCID_(50)/mL降至10~(5.75)TCID_(50)/mL。胞内转染重组质粒pcDNA3.1-flag-KHCct竞争性抑制了kinesin-1功能,RABV N基因降低约25%、N蛋白降低约25%,细胞内病毒感染显著减少,上清病毒滴度由10~(6.75)TCID_(50)/mL降至10~(5.5)TCID_(50)/mL,证明RABV胞内感染也依赖于分子马达kinesin-1。应用抗RABV G蛋白抗体染色,发现ER标志蛋白CNX、PDI与RABV G蛋白有明显共定位。进一步检测发现,RABV P蛋白也与ER标志蛋白CNX、PDI有明显共定位。以上结果表明,RABV感染N2a细胞需要微管及马达分子dynein、kinesin-1运输系统的参与,其中以dynein的作用更大。初步结果显示,内质网参与RABV G蛋白、P蛋白的胞内复制。本实验为进一步研究RABV胞内感染及装配细节奠定了基础。
【图文】：

过程图,病毒,过程,内体

期内体（LE）[20]、循环内体途径（RE）。此后，病毒 RNPs 脱壳被释放到细胞中[40]。在“病毒加工工厂”——尼氏小体内以 RABV RNPs 为模板进行转录复制1]，G 蛋白通过内质网（ER）、高尔基体（Golgi）途径合成，而其他病毒蛋白可能是在位于包涵体近端的游离核糖体上合成[42]。病毒粒子在尼氏体上完成装后出芽到胞外[9]。

微管,重链

两个扇形尾部构成，其尾部与轻链结合[70]。通过头部的 ATP 结合位点结合并水解 ATP，导致颈部构象改变，且两个头部的微管结合位点分别交替与微管结合实现“行走”（如图 2）。两条重链的尾部连接两条轻链的 N-末端疏水性的七肽重复序列，轻链 C-末端 TPR 结构域（34 aa）与运载物的结合，从而将结合的物质（运输囊泡或细胞器）转运到特定位置。其运输方向为微管正端（+），介导货物从细胞中心向外周沿微管进行正向运输。Kinesin-1 是分布最广泛的驱动蛋白之一，有利于细胞质中微管依赖性的正向物质运输[76]。Kinesin-1 属于 N-Kinesin 蛋白，由球状头部、扇形尾端及中间重链杆状构成。生化研究表明，Kinesin-1 N-端具有运动结构域，在重链 C-末端（KHC）具有一个微管结合位点[77]。其可以在神经和非神经细胞中沿微管定向运动，还可竞争性抑制 dynein 介导货物由内质网向细胞核进行负向运输[78, 79]。在 Vero 细胞中过表达 Kinesin-1 重链 C-末端片段（KHCct）的实验表明，，KHCct（residues 771-963）可以通过结合 Kinesin 运动结构域抑制 Kinesin 活性[79]。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S855.3

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