TGF-β、BMP2和性激素相关蛋白对牦牛毛囊周期的调控研究

发布时间：2020-06-02 20:28

【摘要】：牦牛(Bos grunniens)生活在海拔3000~5000 m的高原地区,是该地区的重要畜种之一。据报道,高海拔地区年平均气温在-3~-5°C的范围内;相比海平面年平均气温(16.5~23.1°C),高原地区表现出气温低下的特点。皮肤是直接接触外界环境的器官,其附属物毛囊在寒冷季节产绒,且产生的毛纤维具有很强的防湿能力,有利于牦牛生活在高寒地区。因此,为探索转化生长因子-β(Transforming growth factor,TGF-β)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)和性激素相关蛋白对牦牛毛囊周期的调控特征。本试验以成年雄性牦牛为研究对象,分别采集毛囊休止期、生长早期、生长中期、生长晚期和退行期5个不同生长时期的皮肤样本,进行了以下3个方面的研究:(1)TGF-β和热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是调控毛囊从生长期-退行期转换的重要因子。为了检测TGF-β和HSP70是否参与调控牦牛皮肤毛囊从生长期-退行期的转换。本试验采用免疫组织化学、免疫荧光、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)以及Western blotting等方法,对毛囊生长中期、生长晚期和退行期皮肤样本中TGF-β、Ⅱ型TGF-β受体(Transforming growth factor receptorⅡ,TGF-βRⅡ)、Casepase-3以及HSP70的表达进行检测。结果显示,TGF-β2 mRNA在毛囊不同时期皮肤内的转录水平显著高于TGF-β1和TGF-β3mRNA转录水平;同时,TGF-β2、TGF-βRⅡ及Caspase-3蛋白在毛囊退行期皮肤内的表达高于生长中期;并且免疫荧光双染结果显示,退行期毛囊的部分TGF-βRⅡ阳性细胞呈现TUNEL阳性。HSP70在生长中期的表达高于生长晚期和退行期,且HSP70的最低和最高表达水平与Caspase-3相反。结果表明,TGF-β2在牦牛毛囊退行期的诱导中发挥重要作用,并且其可能通过TGF-βRⅡ的介导途径来诱导毛囊上皮细胞凋亡;相反,HSP70可能通过保护细胞免受凋亡来调控牦牛毛囊向退行期转换。综上所述,TGF-β2和HSP70在牦牛毛囊退行期发生过程中发挥重要的调控作用。(2)BMP2、ⅠA型骨形态发生蛋白受体(Bone morphogenetic protein receptorⅠA,BMPR-ⅠA)及Noggin是参与毛囊休止期-生长期转换的重要蛋白。为了探索BMP2、BMPR-ⅠA和Noggin在牦牛毛囊不同时期皮肤内的表达特征,本试验采用qRT-PCR、Western blotting和免疫组织化学法,对毛囊休止期、生长早期和生长中期皮肤中BMP2、BMPR-ⅠA及Noggin基因和蛋白的表达进行了检测。qRT-PCR和Western blotting结果显示BMP2及BMPR-ⅠA在毛囊休止期皮肤中的表达最高,而Noggin的最高表达出现在生长早期;并且从休止期到生长早期阶段,BMP2及BMPR-ⅠA的表达呈下调趋势,而Noggin的表达呈上调趋势。免疫组织化学结果显示BMP2、BMPR-ⅠA和Noggin分别表达于皮肤表皮、毛囊外根鞘及毛母质细胞。综上所述,BMP2、BMPR-ⅠA和Noggin的特征性表达,提示BMP2和BMPR-ⅠA对牦牛毛囊休止期的维持具有重要的调控作用,而Noggin可能对牦牛毛囊的生长具有重要的调控作用,其主要是通过影响皮肤上皮细胞的增殖和分化来发挥作用。(3)双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)和雌二醇(17β-estradiol,E_2)是潜在的调控人毛囊生长的性激素,其分别在5α还原酶(5α-reductase,5α-red)和芳香化酶(Aromatase)的催化作用下催化睾酮(Testosterone,T)产生。为明确牦牛毛囊是否有性激素合成酶及受体的表达,本试验采用免疫组织化学、qRT-PCR和Western blotting法对毛囊休止期、生长期和退行期皮肤内DHT和E_2合成相关蛋白以及受体的表达进行检测,发现5α-red1、5α-red2和雄激素受体(Androgen receptor,AR)均表达于上皮细胞,并且在毛乳头中也检测到AR的表达。同时,5α-red1 mRNA在毛囊各个时期中的转录水平极显著高于5α-red2mRNA;并且5α-red1和5α-red2蛋白最高表达水平分别见于毛囊生长期和休止期,而AR蛋白仅在毛囊生长期表达。此外,Aromatase及雌激素受体α和β(Estrogen receptorαandβ,ERα和ERβ)均在皮肤上皮细胞中表达,并且在真皮乳头中也有ERα和ERβ的表达。另外,ERαmRNA在毛囊各个时期的转录水平极显著高于ERβmRNA;并且从退行期到休止期,Aromatase和ERβ蛋白的表达呈下调趋势,而ERα蛋白呈上调趋势。DHT相关蛋白的特征性表达可能表明,牦牛皮肤细胞中可能存在DHT的合成途径及作用机制,并且其可能对毛囊的生长具有重要的调控作用;而E_2相关蛋白的表达趋势,提示牦牛皮肤细胞中可能存在E_2的合成途径及其受体的作用机制,并且E_2可能对牦牛毛囊的退化具有重要的调控作用。综上所述,(1)TGF-β2可能通过TGF-βRⅡ的介导途径,参与调控牦牛毛囊的退化过程;而HSP70可能通过参与保护细胞免受凋亡来影响牦牛毛囊的生长;(2)BMP2和BMPR-ⅠA能够通过影响牦牛皮肤上皮细胞的增殖和分化来参与调控牦牛毛囊休止期的维持,而Noggin则可能通过影响牦牛皮肤上皮细胞的增殖,从而在毛囊休止期-生长期的转换中发挥重要的调控作用;(3)牦牛皮肤细胞中存在DHT的合成途径以及作用机制,并且其可能对毛囊的生长具有重要的调控作用;牦牛皮肤细胞中同样存在E_2的合成途径及其受体作用机制,并且E_2可能对牦牛毛囊的退化具有重要的调控作用。这为深入研究上述因子在牦牛毛囊生长周期中的作用及其作用机制提供理论依据,也为进一步揭示牦牛对高原特殊环境的适应机制提供有力支撑。
【图文】：

退行期,牦牛毛,转录水平,皮肤

甘肃农业大学博士学位论文 TGF-β、BMP2 和性激素相关蛋白对牦牛毛囊周期的调控研究异极显著。2 结果2.1 TGF-β mRNA 在牦牛毛囊生长中期、生长晚期及退行期皮肤中的转录水平通过 qRT-PCR 检测发现，TGF-β1、TGF-β2 及 TGF-β3 mRNA 在毛囊生长中期、生长晚期及退行期皮肤内均有表达（图 1A C）。并且 TGF-β2 mRNA 在毛囊生长中期、生长晚期及退行期皮肤内的转录水平极显著高于同时期皮肤内TGF-β1 和 TGF-β3 mRNA 的转录水平（图 1E）。

牦牛皮,毛囊,不同时期,免疫组织化学染色

Figure 1 Levels of TGF-β mRNA in mid-anagen, late-anagen, and catagen yak skin HFs. (A D) PCR electrophoresis results of TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, and β-actin expression. (E) Relativeexpression of TGF-β1, TGF-β2, and TGF-β3 mRNA in mid-anagen, late-anagen, and catagen yakskin HFs. Values indicate the mean ± SEM, n = 3. M: marker. **P < 0.01 indicate significantdifferences versus TGF-β1 and TGF-β3 in the same period.2.2 TGF-β2 和 TGF-βRⅡ在牦牛毛囊不同时期皮肤内的表达2.2.1 TGF-β2 和 TGF-βRⅡ在牦牛毛囊不同时期皮肤内的免疫组织化学检测TGF-β2 和 TGF-βRⅡ在牦牛毛囊不同时期皮肤中的表达结果如图 2 所示。其中，TGF-β2 的阳性表达见于毛囊生长中期的皮肤表皮、毛囊外根鞘、毛母质细胞（图 2A C）以及退行期毛囊的表皮链（图 2D）中。TGF-βRⅡ的阳性表达部位与 TGF-β2 的表达部位一致，其阳性表达也见于皮肤表皮、毛囊外根鞘、毛母质（图 2G I，生长中期）及表皮链（图 2F，，退行期）中。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.85

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