鸡黑素皮质素受体3及其突变体的药理学特性初探

发布时间：2020-06-05 14:24

【摘要】：黑素皮质素受体3(The melanocortin-3 receptor,MC3R)属于G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs),其立体构象中有七次α螺旋跨膜区。该受体被证实在维持动物机体能量平衡、维持钠平衡、参与免疫反应和调节机体昼夜节律等方面起到重要作用。目前,有关人、小鼠和猪等哺乳动物的MC3R及其突变体的体外活性研究已有报道,但对于禽类的MC3R,目前的研究主要集中于基因多态性和经济性状间的关系,而关于禽类MC3R以及其突变型的生理活性的研究较少。为了更深层次的研究鸡MC3R(cMC3R)的功能,了解受体和配体的相互作用规律,同时为进一步的药物筛选或育种优化等提供依据,我们构建了 cMC3R的真核表达载体,并根据已有研究报道中基因多态性与经济性状的关系选取了四个突变位点即:M54L、G104S、L151R和S183S,通过单点突变技术获得这四个突变体,将这5个真核表达载体分别转入人肾上皮细胞系(Human Embryonic Kidney Tcells,HEK293T)中,利用流式细胞仪检测不同基因型受体的胞内总表达和细胞表面表达水平;利用125Ⅰ标记的NDP-MSH进行放射性配体受体结合实验研究cMC3R WT和四个突变与不同配体的结合能力;利用双报告基因法和Western Blot测定了激动剂作用下cMC3R WT(wild type)和四个突变体对胞内环磷酸腺苷水平(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)与磷酸化细胞外调节蛋白激酶 1/2(phosphorylated Extracellular regulated protein kinases 1/2,pERK1/2)水平的影响,以此了解cMC3R基因突变对其受体体外生理功能的影响。结果如下:1、设计特异性扩增引物,得到cMC3RWT全长序列,将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体得到pcDNA3.1(+)-myc/cMC3R-WT。利用点突变技术以pcDNA3.1(+)-myc/cMC3R-WT质粒为模板构建单点突变,成功获得4个突变型cMC3R的真核表达载体。2、将野生型和突变型cMC3R真核表达载体分别转染至HEK293T细胞中,流式细胞仪测定蛋白表达,Triton X-100将细胞膜打孔检测胞内总蛋白表达水平,不打孔的细胞检测细胞表面表达水平。结果显示,cMC3R四个突变体的细胞表面表达和胞内总表达与WT相比均无显著性差异。3、用瞬时表达野生型和突变型cMC3Rs的细胞进行放射性配体受体竞争结合实验,分别用激动剂NDP-、α-、β-、γ-、和D-Trp8-γ-MSH与拮抗剂AGRP与125I-NDP-MSH竞争结合受体。结果显示G104S突变几乎丧失与各配体结合的能力,L151R与配体的亲和力显著上升,M54L和S183S的配体结合能力与WT无显著性差异。4、将野生型和突变型cMC3R真核表达载体与萤火虫荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶报告质粒按固定比例转入HEK293T细胞,检测胞内基础cAMP水平,结果显示,M54L和S183S的胞内基础cAMP水平与WT相比无显著性差异,G104S和L151R与WT相比显著性下降;同时分别选用不同浓度水平的激动剂或拮抗剂在转染后进行刺激再检测胞内cAMP水平,在不同浓度配体的刺激下,WTcCM3R的cAMP水平随着激动剂浓度的增加而上升、随着拮抗剂浓度的上升而下降,在同样浓度的配体刺激下,M54L和S183S的活性与WTcMC3R相似,而G104S和L151R对配体响应的灵敏度下降。5、将带有野生型和突变型cMC3Rs基因转染HEK293T细胞,提取总蛋白,利用Western Blot检测胞内磷酸化ERK1/2基础和配体诱导后的蛋白表达量。结果显示,G104S的胞内磷酸化ERK1/2水平与WT相比有明显下降,但经过配体诱导后的四种突变的磷酸化ERK1/2水平则与野生型没有显著性差异;M54L、L151R和S183S的磷酸化ERK1/2水平与WTcMC3R无显著性差异。同时发现AGRP是一种cMC3R的偏向激动剂。
【图文】：

等分类会有很多种分类方法。目前通用的分类方式将ＧＰＣＲ分为６种亚型，这种分类方式逡逑可以覆盖包括脊椎动物和非脊椎动物在内的所有ＧＰＣＲ［５］。逡逑图１－１邋Ｇ蛋白偶联受体结构示意图逡逑ｆｆｉ体逡逑受体邋Ｉ邋ｒｊＨ？逡逑ｉ邋Ｇ强白逡逑Ｆｉｇｌ－１邋ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆＧ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ邋Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ逡逑（弓Ｉ邋自邋ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｓｏ．ｃｏｍ）逡逑１．２．１紫红质样受体家族逡逑紫红质样受体家族又叫视紫红质样受体，是ＧＰＣＲ中最大的一个亚家族，其受体也是逡逑目前为止研究最多的。紫红质样受体家族的受体结构有很多相似之处，例如，第七个跨膜逡逑区包含ＮｓｘｘＮＰｘｘＹ保守序列，第三个跨膜区与第二个内环交界处会有Ｄ（Ｅ）－Ｒ－Ｙ（Ｆ）保守序逡逑列等等Ｗ。逡逑１．２．２分泌素受体家族逡逑由于第一个被克隆成功的分泌受体属于此受体家族的一员，所以将这个类型的受体命逡逑名为分泌素家族受体。分泌素家族受体的氨基酸具有高度相似性，通常以旁分泌的形式分逡逑泌，可以与许多的多肽配体结合■＝分泌素受体的Ｎ端一般包含６０－８０个氨基酸，通常会出逡逑现保守性非常高的半胱氨酸桥，此结构对于与配体结合的能力非常重要【６］。逡逑１．２．３代谢型谷氨酸受体逡逑代谢型谷氨酸受体的配体识别区域位于２８０至５８０氨基酸的Ｎ末端

逑：ｈ卜…＇逡逑图２－１邋ｃＭＣ３Ｒ基因ＰＣＲ电泳图逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｃＭＣ３Ｒ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ，邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ？邋Ｐｌｕｓ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－６，邋ｃＭＣ３Ｒ邋扩增产物；逡逑Ｍ，邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ？邋Ｐｌｕｓ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－６，邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｃＭＣ３Ｒ逡逑３．２重组ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－／ｃＭＣ３Ｒ－ＷＴ的双酶切和测序结果逡逑对重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｍｙｃ／ｃＭＣ３Ｒ－ＷＴ小提质粒利用￡0？／？／和沿ｗ／双酶逡逑切进行双酶切鉴定，，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见图中约１０００邋ｂｐ出现目的大小的明亮条带，逡逑与ｃＭＣ３Ｒ编码区序列大小一致，将条带大小正确的质粒测序鉴定，测序结果如图２－３。逡逑３０００逡逑２０００逡逑图２－２重组质粒的双酶切鉴定逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＭＣ３Ｒ邋ｄｏｕｂｌｅ邋Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｐｒｏｄｕｃｔ逡逑Ｍ，Ｔｒａｎｓ２Ｋ？ＰｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１－４，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＭＣ３Ｒ邋双酶切产物；５，阳性对照；６，阴性对逡逑照逡逑Ｍ？邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ？邋Ｐｌｕｓ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋ｌ－５？邋ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＭＣ３Ｒ邋ｄｏｕｂｌｅ邋Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｐｒｏｄｕｃｔ；邋５，邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831

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本文编号：2698182