【摘要】：细菌耐药性问题日趋严重,使得有些细菌感染达到了无药可用的境地,因此研发新型抗菌药物成为人们关注的焦点。噬菌体及其裂解酶可以特异、高效地裂解细菌,成为治疗细菌性感染,特别是耐药性细菌感染的一种新型生物制剂,展现出了巨大的应用潜力。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是一种机会致病菌,可以造成多种局部或全身性的感染性疾病。由于抗生素的滥用和粪肠球菌对许多抗生素的固有耐药,使得临床上由治疗粪肠球菌造成的感染变得非常困难。本研究以耐万古霉素粪肠球菌噬菌体EF-P10及其裂解酶LysEF-P10为研究对象,对其作为抗菌制剂的应用潜力及其裂解机制进行了系统研究。本研究首先获得了40株多重耐药的粪肠球菌,并以耐万古霉素的粪肠球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis,VREF)N10为宿主菌从污水中分离并纯化得到了一株烈性噬菌体EF-P10,透射电镜显示其属于长尾噬菌体科,基因组类型鉴定表明EF-P10为双链DNA病毒。EF-P10对其宿主菌表现出了高效的杀菌活性,但裂解谱较窄。对EF-P10进行了全基因组测序,发现EF-P10全长为57 408 bp,具有127个开放阅读框,比对和分析结果表明ORF60所编码的蛋白为其裂解酶LysEF-P10。对LysEF-P10进行了原核表达与纯化,体外实验表明,LysEF-P10具有高效的杀菌活性,其裂解谱远远宽于亲本噬菌体。将粪肠球菌与LysEF-P10连续作用多代不会诱导细菌对LysEF-P10产生抗性,预示其有广阔的应用前景。随后,本研究对LysEF-P10的结构和功能进行了深入研究,通过氨基酸序列比对和分析可知,LysEF-P10包含一个N端CHAP结构域(LysEF-P10C)和C端的假定细胞壁结合结构域(LysEF-P10B)。为了验证各结构域的功能,分别对LysEF-P10C和LysEF-P10B进行了原核表达和纯化。体外杀菌实验表明单独的LysEF-P10C和LysEF-P10B都不具有杀菌活性,只有完整的全酶才具有活性。为了直观地看到与宿主菌结合的结构域,将LysEF-P10C、LysEF-P10B分别和GFP蛋白进行融合,得到LysEF-P10C-GFP和LysEF-P10B-GFP融合蛋白,并用激光共聚焦显微镜检测两个融合蛋白与粪肠球菌N10的结合能力,结果只有LysEF-P10B-GFP能与粪肠球菌N10发生特异性结合,表明LysEF-P10B是LysEF-P10中发挥结合作用的结构域。以金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15的CHAP片段为模板,预测得到了置信度为100%的LysEF-P10C的3D结构,二者在结构上具有很高的同源性。通过序列比对和构建的3D结构模型,预测得到了LysEF-P10C中可能的关键氨基酸位点D20、D22、D31、C29、H90和N110,并将这些位点逐一单位点突变为丙氨酸。圆二色谱结果表明,突变前后蛋白的二级结构没有发生改变。体外杀菌活性表明,EDTA处理后LysEF-P10的活性全部丧失,回补Ca~(2+)活性恢复,这表明Ca~(2+)对维持LysEF-P10的杀菌活性是必需的;D20A、D22A和D31A突变体蛋白活性全部丧失,ICP-AES结果表明突变后Ca~(2+)含量显著降低,回补Ca~(2+)后突变体蛋白活性并没有恢复,这表明D20、D22和D31是结合Ca~(2+)的关键位点;C29A、H90A和N110A突变体蛋白的活性也全部丧失,但ICP-AES结果表明突变后Ca~(2+)含量没有显著变化,说明这三个位点是起催化作用的关键位点。本文进一步评价了LysEF-P10在体内的治疗效果、免疫原性、对肠道菌群的影响及其安全性。治疗实验表明,攻菌后1 h腹腔注射5.0μg LysEF-P10就可以100%保护感染致死剂量VREF的小鼠,且显著降低小鼠血液中的载菌量。免疫原性实验表明LysEF-P10可以诱导小鼠产生针对LysEF-P10的特异性抗体,一次性注射5.0μg LysEF-P10后的第三周抗体滴度达到最高(1:100),主要抗体类型为IgG。中和实验表明anti-LysEF-P10的抗体并不会影响LysEF-P10在体外的杀菌活性,同时体内实验也表明特异性抗体不会影响LysEF-P10在体内的治疗效果。为了评价LysEF-P10在体内应用时对肠道菌群的影响,对小鼠粪便中的细菌进行16S rRNA测序分析,结果表明,当给小鼠腹腔注射致死剂量的VREF 24 h后小鼠粪便中肠球菌属细菌的丰度显著升高,肠道菌群平衡状态受到干扰;攻菌后1 h用5.0μg LysEF-P10对其进行治疗,小鼠粪便中肠球菌属细菌的丰度显著降低,肠道菌群的失衡状态得到一定程度的恢复。单独腹腔注射100.0μg LysEF-P10也会在24 h内使小鼠粪便中肠球菌属细菌的丰度显著降低。对小鼠的安全性试验表明,即使腹腔注射大剂量LysEF-P10(5.0 mg)也不会对小鼠产生明显的副作用,表明LysEF-P10在体内应用时具有良好的安全性。综上所述,本研究为全面解析粪肠球菌噬菌体及其裂解酶的生物学特性以及LysEF-P10在治疗多重耐药粪肠球菌感染中应用打下了坚实的理论与实验基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.611
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