贺兰山岩羊毛尾线虫鉴定及捻转血矛线虫群体遗传分析

发布时间：2020-06-08 03:15

【摘要】：岩羊(Pseudois nayaur)是贺兰山国家级自然保护区内分布最为广泛的小反刍兽类,在我国被列为二级重点保护野生动物。寄生虫病往往会给野生动物的健康带来较大的危害。而目前对于野生岩羊寄生虫病的研究,国内鲜有报道。本研究中,对于救护失败的幼龄岩羊,主要是对毛尾线虫病的病原进行鉴定及遗传进化分析。对于因种群管理而捕获的岩羊,研究工作主要针对的捻转血矛线虫,进行群体遗传学的相关研究。因为捻转血矛线虫在中国小反刍兽类中是一种较为常见的病原体,有较强的致病性。本实验中,我们从救护失败的幼龄岩羊盲肠中发现四条毛尾线虫,根据尾部形态学结构的差异,初步鉴定为两种(T skrjabini和Trichuris.sp)。为了更准确的鉴定,我们利用巢式PCR方法的扩增了这四条毛尾线虫的18S-ITS1-5.8S的片段基因,进行分子学鉴定以及遗传进化分析。基因序列比对发现,依据形态学结构分成的两种毛尾线虫,无论是种间还是种内18S序列及5.8S序列较为保守;ITS1序列的种间差异较大,范围在10.69%～11.29%之间,而种内的ITS1序列的差异较小,仅为0.20%～1.06%。对这四条毛尾线虫进行遗传进化分析,与形态学的鉴定结果一致,这四条毛尾线虫在进化树上分为独立的两个进化枝。其中一种与T.skrjabini构成姐妹类群(Clad A)。因此感染此幼龄岩羊的毛尾线虫其中一种为T.skrjabini(Clad B)。另外一种岩羊毛尾线虫在进化树上与来自黑山羊的毛尾线虫聚集在一起。因此,在贺兰山分布的野生岩羊受到来自两种不同的毛尾线虫病原的威胁。本实验中,我们从因种群管理而捕获的5只老弱病残岩羊体内分离得到57条捻转血矛线虫,又从岩羊自然栖息地的附件的一个山村(第七农场大队)内的家养绵羊内采集到20条捻转血矛线虫。通过PCR方法,扩增得到这77条捻转血矛线虫的ITS2全序列。序列分析表明这77条虫均属于捻转血矛线虫,且共有10个基因类型。其中GT1、2以及3为主要的ITS2基因类型,岩羊捻转血矛线虫和绵羊捻转血矛线虫的ITS2核苷酸多样性分别为0.008和0.004。通过PCR方法,扩增出这77条捻转血矛线虫的nadh4基因片段进行种群遗传分析,其中有73个单倍型,55个来自岩羊,18个来自绵羊,单倍型多样性分别为0.999和0.995。此外又从数据库中下载了中国其他七个地区的家养反刍类(绵羊、山羊)的捻转血矛线虫nadh4单倍型序列,共计142条。AMOVA分析有94.21%的变异是出现种群内部,仅有5.35%的变异出现种群间。无论进化树拓扑结构还是单倍型网络图,来自野生岩羊与家养反刍类的捻转血矛线虫之间无任何分化。种群间Fst数值趋近0,种群间的基因流指数Nm几乎全部大于1。因此野生岩羊捻转血矛线虫种群与家养反约类捻转血矛线虫种群之间无种群分化,且存在较高的基因流。
【图文】：

照片,虫卵,形态学,尾部

２．４．１岩羊毛尾线虫形态学特征逡逑经２．２．１步骤处理后，共从该岩羊的盲肠中分离得到４条毛尾线虫成虫。显微镜下逡逑观察，，均为雌性。根据尾部形态学特征，初步可以分为两种。形态如图２－１所示：逡逑丨歐：秦逡逑图２－１两种毛尾线虫尾部形态学及虫卵结构照片。比例尺：ａ，邋１００邋ｐｍ；邋ｂ，２０邋ｐｍ；邋ｃ，１００邋ｐｍ；邋ｄ，邋２０邋ｐｍ．逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ邋ｓｐｅｃｉｅｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｗｉｌｄ邋ｂｌｕｅ邋ｓｈｅｅｐ，邋ａ．邋ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ逡逑ｅｎｄ邋ｏｆ邋Ｔ．邋ｓｂｊａｂｉｎｉ；邋ｂ．邋ｅｇｇｓ邋ｏｆ邋Ｔ．邋ｓｋｒｊａｂｉｎｉ；邋ｃ．邋ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ邋ｅｎｄ邋ｏｆ邋Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ．邋ｓｐ＼邋ｄ．邋ｅｇｇｓ邋ｏｆ邋Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ．邋ｓｐ．邋Ｓｃａｌｅ逡逑ｂａｒｓ：邋ａ，邋１００邋｜ｉｍ；邋ｂ，邋２０邋＾ｉｍ；邋ｃ，邋１００邋ｆｉｍ；邋ｄ，邋２０邋｜ｉｍ．逡逑图２－１中的ａ和ｂ属于其中一类毛尾线虫成虫和虫卵，ｃ和ｄ属于毛尾线虫的另一逡逑种。上图箭头所示，毛尾线虫的尾部结构出现明显的差异。对于这两种类型毛尾线虫虫逡逑卵，两端都存在明显的栓塞。此外，对两种类型虫卵的大小进行了测量。１＞：７１．０５－逡逑７６．５６邋ｘ邋３７．６３邋－邋４０．５２邋（７４．２２邋ｘ邋３８．８４，邋ｎ邋＝邋１２）邋；邋ｄ：邋６３．３８邋－邋７３．０８邋ｘ邋３４．８４邋－邋３７．１９邋（６８．１９邋ｘ逡逑３６．２６

岩羊,序列比对,长度范围,序列长度

序列号为ＭＧ５７３３０５邋－邋ＭＧ５７３３０８。经序列的注释解析，四条１８Ｓ－ＩＴＳ１－５．８Ｓ逡逑序列的中１８Ｓ的长度为２６２邋－邋２６２ｂｐ，ＩＴＳ１序列的长度范围为（４７０到４９５ｂｐ），扩增得逡逑到的５．８Ｓ的序列长度一致，均为ｌｌｂｐ下图（
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.9

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